一種血清miRNA生物標志物的應用制造技術

一種血清miRNA生物標志物的應用，涉及生物標志物。所述血清miRNA生物標志物包括miR-34c、miR-1275、miR-375、miR-410、miR-758中的至少一種。所述血清miRNA生物標志物可在制備少精癥和無精癥檢測試劑中應用。所述血清miRNA生物標志物組合物包括miRNA中的至少一種以及各miRNA的反轉錄引物、正向引物和反向引物的序列；所述血清miRNA生物標志物組合物可在制備少精癥和無精癥檢測試劑中應用。確定的miRNA組合與少精癥和無精癥的病例指標的密切相關性，能夠作為生物標記物對少精癥和無精癥病人進行篩查和診斷，為臨床個體化干預治療提供有效依據。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物標志物，尤其是涉及一種血清miRNA生物標志物的應用。技術背景不孕不育是全球性醫學問題，據世界衛生組織統計，全球約有5％～10％的育齡夫妻存在不孕不育問題，其中男性原因所致不育占一半左右。有90％的男性不育癥是由生精障礙引起，臨床上表現為無精子癥或少精子癥。少精癥是指每毫升精液中精子少于2000萬，因為精子數量少，與卵子相遇的機會就少，導致男性不育。無精癥約占男性不育癥患者的15％～20％。無精癥是指多次精液檢查(一般3次以上)均未發現精子。無精癥患者必要時可做睪丸活檢、精道造影、內分泌激素放免測定等，以協助鑒別阻塞性無精子或先天性無精子。目前相關研究大多從單個基因的角度探討少精癥和無精癥的病因，但單個基因的改變并不能完全解釋他們的致病機制。miRNA(microRNA)是一類長約22nt的非編碼小RNA，廣泛存在于各種生物中，調節生物體生長、發育和凋亡等過程。由此形成的復雜遺傳學網絡，是生物體生長發育的基礎。miRNA在人和動物睪丸發育及精子生成等過程也起著重要的調控作用。研究報道在成年果蠅體內去除一個miRNA(let-7)，就能導致不孕不育。因為像let-7這樣的miRNA承擔了重要的功能，在進化中非常保守，廣泛存在于人類和許多其他動物體內(Fagegaltier?D,A,Gordon?A,et?al.A?genome-wide?survey?of?sexually?dimorphic?expression?of?Drosophila?miRNAs?identifies?the?steroid?hormone-induced?miRNA?let-7as?a?regulator?of?sexual?identity[J].Genetics,2014,198(2):647-668.)。miRNA在血清中可長期穩定存在，耐RNA酶降解，煮沸、反復凍融、酸堿環境、長期保存等各種處理方法均不會造成血清miRNA的損失，因此血清中的miRNA有潛力作為一種有價值的篩查或者診斷的標志物，其受外來干擾因素影響小，臨床實用性強。甚至常規體檢中就可以收集到的血液。由于血液會循環至全身所有組織，向細胞輸送營養并清除廢物，因此血液能夠反映出整個機體的生理病理狀況，其檢測結果對人體健康具有指導意義。并且，基于血清的檢測是無創的、非侵入的，因此可以適用于普查，為早期診斷服務。少精癥和無精癥患者血清的miRNA檢查不僅可以輔助診斷，避免進行睪丸活檢等創傷性檢查，或者一些無效的治療，更主要的是可以避免將這種缺陷遺傳給下一代。由于血清中miRNA的表達量較低，尋找一種靈敏度高、操作簡便且成本低廉的檢測方法是目前血清miRNA應用于臨床檢測亟待解決的問題，實時熒光定量PCR是目前檢測血清miRNA的主要方法，該方法快速、便捷，精確度和靈敏度可滿足臨床需求。另外，在選擇標志物時，應優先選擇在疾病中表達上調的血清miRNA，這樣也可提高檢測的靈敏性和特異性。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種血清miRNA生物標志物的應用。所述血清miRNA生物標志物包括以下所列miRNA中的至少一種：miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；miR-1275：gugggggagaggcuguc；miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；miR-410：agguugucugugaugaguucg；miR-758：gaugguugaccagagagcacac。所述血清miRNA生物標志物可在制備少精癥和無精癥檢測試劑中應用。所述血清miRNA生物標志物組合物包括miRNA中的至少一種以及各miRNA的反轉錄引物、正向引物和反向引物的序列；所述miRNA包括：miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；miR-1275：gugggggagaggcuguc；miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；miR-410：agguugucugugaugaguucg；miR-758：gaugguugaccagagagcacac；所述各miRNA的反轉錄引物、正向引物和反向引物的序列如下表所示：所述血清miRNA生物標志物組合物可在制備少精癥和無精癥檢測試劑中應用。所述少精癥和無精癥檢測試劑用于檢測少精癥和無精癥的方法采用莖環的反轉錄-熒光定量PCR方法，即SYBR?Green染料法，具體步驟如下：1)血清樣本采集和臨床分組：從醫院采集血清樣本，同時系統收集患者的病理學資料；2)用Qiagen公司商品化的總RNA提取試劑盒miRNeasy?Serum/Plasma?kit(cat.no.217184)從受試樣本血清中提取總RNA，通過Agilent?miRNA?microarray高通量篩選出候選miRNA；3)采用實時熒光定量PCR方法篩選可用作檢測標志物的miRNA。本專利技術使用的檢測方法可以選自：RT-PCR方法、Microarray技術、Real-time?PCR方法等中的至少一種。本專利技術具有以下技術效果：首先，血清相對其它組織樣本較易獲得，與睪丸活檢或者睪丸穿刺相比，來源方便性能穩定，而且屬于無創性檢查檢，極大地方便了醫療人員的使用，減輕了患者的痛苦。其次，本專利技術確定的miRNA組合與少精癥和無精癥的病例指標的密切相關性，能夠作為生物標記物對少精癥和無精癥病人進行篩查和診斷，為臨床個體化干預治療提供有效依據。最后，通過實時熒光定量PCR技術對少精癥和無精癥病人的血清水平miRNA的檢測，定量準確，方便可靠。本專利技術確定的miRNA組合與少精癥和無精癥的病例指標的密切相關性，能夠作為生物標記物對少精癥和無精癥病人進行篩查和診斷，為臨床個體化干預治療提供有效依據。為今后少精癥和無精癥血清miRNA的研究提供了理論依據，并為少精癥和無精癥的分子診斷提供了新思想，具有一定的理論意義和潛在的實用價值。本專利技術還同時提供了一種用于少精癥和無精癥檢測的熒光定量檢測引物組合物，該引物組合物包括所述血清miRNA組合物中各miRNA的檢測引物。附圖說明圖1是本專利技術miRNA生物標志物篩選的主要流程圖。圖2是顯示miR-34c在少精癥患者、無精癥患者和正常對照組中表達存在明顯差異對比圖。圖3是顯示miR-1275在少精癥患者、無精癥患者和正常對照組中表達存在明顯差異對比圖。圖4是顯示miR-375在少精癥患者、無精癥患者和正常對照組中表達存在明顯差本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種血清miRNA生物標志物，其特征在于包括以下所列miRNA中的至少一種：miR?34c：aggcaguguaguuagcugauugc；miR?1275：gugggggagaggcuguc；miR?375：uuuguucguucggcucgcguga；miR?410：agguugucugugaugaguucg；miR?758：gaugguugaccagagagcacac。

【技術特征摘要】
1.一種血清miRNA生物標志物，其特征在于包括以下所列miRNA中的至少一種：
miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；
miR-1275：gugggggagaggcuguc；
miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；
miR-410：agguugucugugaugaguucg；
miR-758：gaugguugaccagagagcacac。
2.如權利要求1所述血清miRNA生物標志物在制備少精癥和無精癥檢測試劑中應用。
3.如權利要求2所述應用，其特征在于所述少精癥和無精癥檢測試劑用于檢測少精癥和
無精癥的方法采用莖環的反轉錄-熒光定量PCR方法，即SYBR?Green染料法，具體步驟如下：
1)血清樣本采集和臨床分組：從醫院采集血清樣本，同時系統收集患者的病理學資料；
2)用Qiagen公司商品化的總RNA提取試劑盒miRNeasy?Serum/Plasma?kit(cat.no....

【專利技術屬性】
技術研發人員：曾驥孟，李志明，顧龍，莊炫，
申請(專利權)人：廈門大學，
類型：發明
國別省市：福建;35