本發明專利技術公開了來源于棉花的miRNA-GhmiRnC及其應用。本發明專利技術保護的miRNA-GhmiRnC是序列表的序列1所示的RNA。本發明專利技術保護的miRNA-GhmiRnC前體（pre-GhmiRnC）是序列表的序列2所示的RNA。本發明專利技術還保護序列1所示RNA在抑制鈣調素結合蛋白基因表達和/或促進鈣調素結合蛋白基因的mRNA降解中的應用。所述鈣調素結合蛋白如序列表的序列3所示。所述鈣調素結合蛋白基因如序列表的序列4所示。應用miRNA-GhmiRnC有望獲得在棉花纖維長度，強度有重要表型的植株，具有重要的生物學意義和潛在應用價值，將為棉花的品質育種（如培育抗逆性棉花）提供寶貴的基因資源，帶來一定的研究價值和社會效益，并最終用于實際生產。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
,尤其涉及一種來源于棉花的HiiRNA-GhmiRnC及其應用。
技術介紹
miRNA (microRNA,微小RNA)是一類長度約為20_24nt的內源單鏈非編碼小分子 RNA,在生物體中廣泛存在(Bartel D P. MicroRNAs:genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004，116:281-297. )。近年來大量研究表明，miRNA 能夠調控生物體中許多基因的表達，在調節生長發育、細胞增殖、凋亡、抵御環境脅迫等諸多方面發揮重要作用(Bushati N, Cohen S M. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. , 2007, 23:175-205.;金龍國，王川，劉進元·植物MicroRNA.中國生物化學與分子生物學報，2006，22:609-614.)。植物miRNA主要通過切割靶基因mRNA，或抑制靶mRNA翻譯，來調控植物個體生長發育并影響其生理過程，是一種新的基因調控模式，具有重要的石開究意義(Voinnet 0. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs.Cell,2009, 136:669-687.)。棉花是世界最重要的經濟作物之一，同時棉花纖維也是研究單細胞伸長的良好模型。與擬南芥、水稻等模式生物相比，目前已經發現的棉花miRNA數量可謂寥寥無幾，因此通過高通量測序技術，有望挖掘出更多的棉花miRNA，這對于全面了解棉花乃至整個植物miRNA的形成過程、結構特點和功能機制具有現實意義。另外，棉花中miRNA可能在諸多生理過程(如纖維的起始與伸長等)發揮重要功能，但棉花中關于miRNA的生物學功能研究甚少，因此，通過關注特定發育時期、特定組織中的miRNA，有望闡明棉花miRNA參與的生理過程，以及在該過程中具體發揮的作用。我國是世界上主要的棉花生產和消費國，棉花對于我國具有舉足輕重的地位。國內外除了利用常規育種手段之外，逐步運用基因工程技術對棉花纖維產量、品質、抗蟲等進行遺傳改良已經成為了一種趨勢。由于miRNA對植物有廣泛的調控作用，很可能成為植物遺傳改良的重點研究基因之一，因此迫切需要通過大規模測序方法充分挖掘和開發屬于本國知識產權的新的miRNA基因，從而為后期定向改良和培育優質性狀的棉花品種奠定基礎。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供來源于棉花的HiiRNA-GhmiRnC及其應用。本專利技術提供了 miRNA-GhmiRnC，為單鏈RNA,為序列表的序列I所示的RNA，序列如下(5，一 3，)UAAGUGAAGAAAGAGGUAGGUU。本專利技術還提供miRNA-GhmiRnC前體(pre_GhmiRnC),為單鏈RNA,為序列表的序列2所示的 RNA，序列如下(5’ 一 3’)GAAGGACAACUAAGUGAAGAAAGAGGUAGGUUUGAAGAAGAAGAUGGUAAGCUGAGUUUAAGAGGAAUGGUGAACUUAAUUGAGAUCAUCUUCUCCUAGUUUUC⑶CACAUGAACCUUUCUUCAUUUAGAUCUUCAAACCAGCCUUUUCUUCACUUAGUUGUCCUUCCo序列I所不RNA或序列2所不的RNA在抑制韓調素結合蛋白基因(TC259543)表達中的應用也是本專利技術保護的范圍；所述鈣調素結合蛋白的氨基酸序列為序列表的序列3 ；所述鈣調素結合蛋白基因的核苷酸序列為序列表的序列4或序列表中序列4自5’末端第194-745位核苷酸。序列I所示RNA或序列2 所示的RNA在促進鈣調素結合蛋白基因的mRNA降解中的應用也是本專利技術保護的范圍；所述鈣調素結合蛋白的氨基酸序列為序列表的序列3 ;所述鈣調素結合蛋白基因的核苷酸序列為序列表的序列4或序列表中序列4自5’末端第194-745位核苷酸。其中，促進鈣調素結合蛋白基因的mRNA降解為切割鈣調素結合蛋白基因的mRNA。序列I所示RNA或序列2所示的RNA在棉花纖維品質改良中的應用也是本專利技術保護的范圍。Solexa克服了常規miRNA克隆技術的缺點，具有靈敏度高的優點，能夠檢測出最少一個小RNA分子，并且準確性高，檢出的小RNA分子堿基錯誤率極低。HiSeq 2000是Illumina公司2010年推出的一款新的測序儀，采用穩定的可逆終止法邊合成邊測序技術。該技術使用4種含有末端阻斷基團和不同熒光信號的堿基進行模板互補鏈的合成，不僅確保了測序的高精確性和高順序性，而且排除了由重復序列和同聚物導致的測序錯誤。融合了最新的光學系統和制造工藝，該光學系統采用2個激光源對Flowcell進行掃描，并使用4臺照相機對4種堿基分別進行記錄，大幅度減少了不同堿基之間的信號干擾，提高了測序系統的準確度。同時，HiSeq 2000使用了新穎的雙表面成像技術，增加了 Flowcell的有效面積,從而提高測序產量和降低成本。每個文庫的測序量至少達到1500萬條小RNA序列以上。基于這種最新的測序手段，將有望識別棉花中特定發育時期特定組織特異表達的新miRNA。本專利技術的實驗證明，本專利技術采用國際上先進的Solexa高通量測序技術，最新的HiSeq 2000測序儀結合生物信息學分析、5’ RACE等多種生物學手段，首次從基因組水平鑒定到miRNA-GhmiRnC，并且證實GhmiRnC的靶基因為鈣調素結合蛋白，該基因參與了棉花纖維伸長和次生壁增厚的發育調控，這都將為棉花的品質育種(如提高棉纖維產量)提供寶貴的基因資源，帶來一定的研究價值和社會效益，并最終用于實際生產。本專利技術提供的miRNA廣泛參與了棉花多種生命活動的調節，具有重要的生物學意義和潛在應用價值。附圖說明圖I為小RNA測序數據中分離和鑒定新miRNA的流程圖。圖2為棉花開花后5天、10天、15天、20天和25天纖維小RNA庫中GhmiRnC的測序數；所有數字均代表歸一化為每1，000萬“干凈”序列(“干凈”序列見小RNA文庫中新的miRNA的鑒定部分中的解釋)中的數目。圖3為GhmiRnC的前體二級結構圖。圖4為GhmiRnC的靶基因5’ RACE驗證；序列上方的箭頭表示發生切割的位點，數值表示該切點處發生切割的克隆數與克隆總數比值。圖5為實時定量RT-PCR檢測靶基因的表達；誤差線表示相對標準偏差。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下的實施例便于更好地理解本專利技術，但并不限定本專利技術。下述實施例中的％,如無特殊說明,均為質量百分含量。以下實施例中所用棉花品種均為陸地棉中棉35 (Gossypium hirsutumcv. CRI35)，棉花種子來源于中國農業科學院棉花研究所。編號國審棉990005。實施例I、miRNA-GhmiRnC 的發現 一、樣品采集棉花于每年四月下旬種植于田間，常規作業，開花前一天花苞套袋，防止花粉傳播造成異花傳粉，開花當天除袋，并掛牌標記。分別收取開花后5、10、15、20、25天的棉鈴，去除棉鈴殼，將種子及纖本文檔來自技高網...
【技術保護點】
序列表的序列1所示的RNA。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉進元，薛偉，王正明，
申請(專利權)人：清華大學，
類型：發明
國別省市：
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