利用麥麩水解液制備米根霉菌球的方法技術

本發明專利技術涉及一種利用麥麩水解液制備球狀根霉屬真菌的方法，調制麥麩水溶液的濃度為80~120g/L，硫酸調pH為2，攪拌均勻；在121℃水解，每1L麥麩水解混合物中加入4~15g/L?Ca(OH)2，混合物pH為4~9；混合物離心進行固液分離，上清液即為麥麩水解液。將米根霉培養在35℃、7天、PDA斜面上，在室溫條件下，用無菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制備成104~109個/mL的孢子懸液備用。加入麥麩水解液，加入CaCO3，接入1mL米根霉孢子懸液培養14~20h。獲得直徑區間為2.6~0.71mm尺寸均一的米根霉菌球。本發明專利技術降低了生產成本；擺脫了絲狀真菌培養過程中對pH的依賴，適合工業化應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物工程領域，涉及一種利用麥麩水解液制備球狀根霉屬真菌的方法，具體涉及利用農業廢棄物麥麩作為底物，通過調節培養基中玉米漿的初始濃度，從而實現對根霉屬真菌菌球的制備和調控。
技術介紹
根霉屬絲狀真菌廣泛應用于生產高附加值的工業產品，如有機酸、酶制劑、抗生素、殼聚糖等。其在深層液體發酵過程中，球狀顆粒是最佳的菌體形態，同時，菌球的尺寸也直接影響著目標產物的產量和生產效率(Liu, Y.，W. Liao, and S. Chen, Study ofpellet formation of filamentous fungi Rhizopus oryzae using amultiple logisticregression model. Biotechnology and Bioengineering, 2008.99 (I): 117-128. X 絲 狀真菌菌球的最適尺寸區間在不同的發酵系統中存在很大差異，過大的菌球使菌體的傳氧傳質受阻，直接導致菌體的生理代謝水平和目標產物的生物合成效率下降；過小的菌球會使菌體內部形成致密的結構，導致菌球中心部分的菌絲失去活性而無法正常的代謝(Sitanggang, A. B.，Wu, H. S.，Wang, S. S.，Ho, Y. C. 2010. Effect of pellet size andstimulating factor on the glucosamine productionusing Aspergillus sp.BCRC31742. Bioresource Technology, 101 (10)，3595-3601.)。因此，控制合適的菌體形態和菌球尺寸是保證根霉屬真菌充分發揮其發酵性能的關鍵。在傳統的絲狀真菌菌球制備和調控工藝中，菌體形態和菌球尺寸的大小受不同預培養條件，如中和劑、培養基成分、培養溫度、培養基黏度等多種因素的影響。有文獻報道，通過調節培養基的初始PH，以及金屬離子，如鋅、鎂、鐵和錳的初始濃度來控制菌體形態，并實現對菌球尺寸的調節(Zhou, Y.，Du, J.，Tsao, G. T. 2000. Mycelialpellet formation by Rhizopus oryzae ATCC 20344. AppliedBiochemistry andBiotechnology, 84 (I)，779-789. )。2011年，Zhou等人報道了通過調節培養溫度、攪拌速度以及培養基成分如葡萄糖、蛋白胨的初始濃度來調節米根霉菌球直徑的大小，以滿足發酵富馬酸的需要(Zhou, Z. , Du, G. , Hua, Z. , Zhou, J. , Chen, J. 2011. Optimization offumaric acid production by Rhizopus delemar basedon the morphology formation.Bioresource Technology.)。但這些米根霉菌球培養條件受環境擾動劇烈,控制工藝復雜，可操作性差，不利于工業化放大和推廣應用。因此，建立一種高效的、能利用低值原料、受環境擾動小的絲狀真菌菌球制備和調控策略對工業發酵中，利用根霉屬絲狀真菌生物合成如富馬酸、乳酸、殼聚糖、纖維素酶等高附加值生物基產品具有重要的意義。麥麩是小麥制粉工業中的農業廢棄物，在中國每年有將近1000萬噸麥麩產生，其價格約為精制糖的1/8，主要作為動物飼料來使用。在現代的生物煉制工業中，環境友好型的處理技術已能夠將麥麩這種富含纖維素(4(Γ61%)、蛋白質(15 20%)、淀粉(10 20%)、維生素(O. 5^0. 9%)的廉價農業廢棄物轉化成微生物可以直接利用的生物質資源，用來生產具有高附加值的生物基平臺化合物，如L-乳酸、丁醇、乙醇等(Liu, Z.，et al.，Butanolproduction by Clostridiumbeijerinckii ATCC 55025from wheat bran.Journal ofIndustrial Microbiology andBiotechnology, 2010. 37 (5) :p. 495-501. ) 然而，關于高效利用農業廢棄物麥麩制備根霉屬絲狀真菌菌球的研究尚未見報導，需要做大量的實驗研究，以獲得能夠利用麥麩的最適合根霉屬絲狀真菌菌球制備方法。
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種利用麥麩水解液制備球狀根霉屬真菌的方法，使本工藝能高效的調節根霉屬真菌的菌體形態和菌球尺寸，以滿足發酵過程中對根霉屬真菌菌體形態的要求，提高目標產物的產量和生產效率。為了實現本專利技術的目標，本專利技術的技術方案如下本專利技術公開了一種利用麥麩水解液制備球狀根霉屬真菌的方法，步驟如下 (I)調制麥麩水溶液的初始濃度為8(Tl20g/L，用硫酸調pH為2，攪拌均勻；在121°C、水解時間為4(T90min的條件下進行水解，自然冷卻；每IL麥麩水解混合物中加入ri5g/L Ca (OH) 2，攪拌均勻進行脫毒處理，使麥麩水解混合物pH為4、；脫毒后的麥麩水解混合物離心進行固液分離，上清液即為麥麩水解液，獲得的麥麩水解液滅菌備用。(2)將米根霉培養在35°C、7天、PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)斜面上，在室溫條件下，用無菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制備成IO4IO9個/mL的孢子懸液備用。(3)在三角瓶中，以裝液量I :3飛的體積比(v/v)加入麥麩水解液，加入2g/L的CaCO3，接入ImL米根霉孢子懸液培養14 20h。可獲得直徑區間為2. 6^0. 71mm、光滑分散、尺寸均一的米根霉菌球。通過調節初始階段玉米漿的添加濃度(T5g/L，可以控制米根霉菌球直徑區間為2.6 0. 71mm。所用水溶液的為自來水、蒸餾水、重蒸水或去離子水。對麥麩水解混合物進行固液分離過程中，分離裝置為離心機、板框過濾或濾布過濾。所用無菌水為無菌蒸餾水、無菌去離子水或無菌重蒸水。本專利技術所用菌種不局限于絲狀真菌米根霉，也可以為根霉屬的其它絲狀真菌。本專利技術的有益效果在于(I)利用農業廢棄物麥麩作為底物，無需固定化載體制備米根霉菌球，大幅地降低了生產成本；(2)僅通過調節玉米漿的初始濃度，即可實現對絲狀真菌米根霉菌球尺寸的調控，操作工藝簡單；(3)培養pH不需要精確控制，擺脫了絲狀真菌培養過程中對pH的依賴，適合工業化應用。附圖說明圖I :在玉米漿初始濃度為4g/L條件下(CaC032g/L、麥麩水解液100g/L、200rpm、35°C、培養16h)，獲得的平均直徑為I. 25mm的米根霉菌球。具體實施例方式下面結合具體的實施例對本專利技術做進一步說明實施例I :麥麩的濃度80g/L(其取值范圍在8(Tl00g/L)，用10mol/L硫酸調pH為2，攪拌均勻。在121°C、水解時間為45min(其取值范圍在4(T60min)的條件下進行水解，自然冷卻至室溫10°C ;每IL麥麩水解混合物中加入約4g(其取值范圍在4 6g)的Ca(OH)2，攪拌均勻進行脫毒處理，使麥麩水解混合物的PH約為4，進行離心，上清液即為麥麩水解液，獲得的麥麩水解液在115°C、30min的條件下滅菌備本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用麥麩水解液制備球狀根霉屬真菌的方法，其特征在于步驟如下：（1）調制麥麩水溶液的初始濃度為80~120g/L，用硫酸調pH為2，攪拌均勻；在121℃、水解時間為40~90min的條件下進行水解，自然冷卻；在麥麩水解混合物中加入4~15g/L？Ca(OH)2，攪拌均勻進行脫毒處理，使麥麩水解混合物pH為4~9；脫毒后的麥麩水解混合物進行固液分離，液體部分即為麥麩水解液，獲得的麥麩水解液滅菌備用；（2）將米根霉培養在PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)斜面上，在室溫條件下，用無菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制備成104~109個/mL的孢子懸液備用；（3）在三角瓶中，以裝液量1：3~6的體積比加入麥麩水解液，加入2g/L的CaCO3，接入1mL米根霉孢子懸液，培養14~20h；獲得直徑區間為2.6~0.71mm的米根霉菌球。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：聞建平，于守智，王冠一，
申請(專利權)人：天津大學，
類型：發明
國別省市：