裂殖壺菌及其高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一株裂殖壺菌，該菌株為裂殖壺菌（Shizochytrium?sp.）WZU6961，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?NO.6369。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了上述裂殖壺菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法。以裂殖壺菌WZU6961高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA，得到的發(fā)酵液中生物量濃度92.4~103.2g/L，生物量中DHA含量20.9%~21.9%，DHA生產(chǎn)率達(dá)到7.2~8.5g/(L·d)，高于現(xiàn)有技術(shù)，有利于裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的產(chǎn)業(yè)化。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種裂殖壺菌及其高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，屬于微生物應(yīng)用

技術(shù)介紹
二十二碳六烯酸(DHA，C22:6-4 , 1Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)是大腦、視網(wǎng)膜的重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，還能夠調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、預(yù)防和治療心血管疾病、消除炎癥、抑制癌癥。長期以來，DHA的主要來源是從鯡魚、鯖魚、鮭魚和鰛魚等富含油脂的魚類中提取出來的魚油。魚油帶著濃烈的、難聞的、特征性的海腥味，其品質(zhì)因提取魚油所用的魚種及捕撈季節(jié)和地點(diǎn)的不同而差異很大，還因環(huán)境污染而降低，在食品和醫(yī)藥中的應(yīng)用因而受到嚴(yán)重限制。魚油所含的脂肪酸很復(fù)雜，其鏈長和飽和度各不相同，從中提取和純化DHA的成本很高。人 們因此需要尋找替代來源(Sijtsma L, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64:146 - 153)。裂殖壺菌無論在實(shí)驗(yàn)中還是商業(yè)上都是DHA的卓越生產(chǎn)者(Bailey R B, et al. US Patent 6607900, 2003)。它不致病、不產(chǎn)毒，人類通過食物鏈中的貽貝和蛤直接攝食之，美國FDA將其列為公認(rèn)安全級(GRAS,Generally Recognized asSafe)。自上個(gè)世紀(jì)90年代FAO和WHO等機(jī)構(gòu)推薦在嬰、幼兒食品配方中添加DHA以來，裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA受到更加廣泛的關(guān)注，技術(shù)水平不斷提高。S. Iimacinum SR21 培養(yǎng) 5 d，DHA 生產(chǎn)率 0. 8 g/ (L · d) (Yokochi T, et al.Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49: 72 - 76)。51. mangrovei Raghu Kumar 培養(yǎng)107 hr, DHA 生產(chǎn)率 0. 5 g/ (L · d) (Bowles R D, et al. J Biotechnol, 1999，70: 193-202)。一株5 mangrovei 培賽 hr，DHA 生產(chǎn)率 I. 27 g/(L *d) (Fan K ff, et al. JInd Microbiol Biotechnol, 2001, 70: 199 - 202)。S. aggregatum ATCC 28209 培養(yǎng)96 hr，DHA 生產(chǎn)率 3. 42 g/(L ·(!)(姜悅，等·中國專利 1218035C, 2005)。5 limacinum0UC88培養(yǎng)5 (1，0擬生產(chǎn)率1.65 g/(L*d)(張學(xué)成，等.中國專利1264967C, 2006)。S.limacinum G13/2S培養(yǎng)110 hr(葡萄糖初始濃度150 g/L，60 hr后再添加65 g/L)，DHA生產(chǎn)率 3 g/(L · d) (Ganuza E, et al. Biotechnol Lett, 2008, 30: 1559 - 1564)。S.WZU4771 培養(yǎng) 5 d，DHA 生產(chǎn)率 2. 76 g/(L .d)(趙肖為，等.中國專利 100503811C, 2009)。一株裂殖壺菌培養(yǎng)5 d (葡萄糖初始濃度125 g/L，降至10 g/L時(shí)流加葡萄糖以維持其濃度在10 20 g/L)，DHA生產(chǎn)率1.66 g/(L*d)(陳麗珠，等.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2009，48(1) : 84 - 88)。S. CCTCC M209059 在 5000 L 發(fā)酵罐中培養(yǎng) 5 d (葡萄糖初始濃度100 g/L，降至10 20 g/L時(shí)流加葡萄糖以維持其濃度在50 100 g/L)，DHA生產(chǎn)率2. 59 g/(L ·(!)(黃和，等.中國專利101575584B，2010);在1000 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)132 hr (葡萄糖初始濃度40 g/L，降至15 g/L時(shí)流加葡萄糖以維持其濃度在15 40 g/L), DHA 生產(chǎn)率 2. 86 g/(L · d) (Ren L J, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2010)。S. limacinum ATCC 20888在500 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)90 hr (葡萄糖初始濃度45 g/L，降至35 g/L時(shí)流加葡萄糖)，DHA生產(chǎn)率4.86 g/(L*d)(徐從英，等·中國專利101519676B，2011)。一株裂殖壺菌在8000 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)5 d (葡萄糖初始濃度120 g/L，然后流加葡萄糖以維持其濃度在8 10 g/L)，DHA生產(chǎn)率6 g/(L · d)(鐘惠昌，等.中國專利101812484B, 2012)。上述現(xiàn)有技術(shù)的DHA生產(chǎn)率雖然不斷攀升，但還不夠高，因此，DHA由裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)替代從魚油中提取的關(guān)鍵在于進(jìn)一步提高DHA生產(chǎn)率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中DHA生產(chǎn)率過低。為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供一種裂殖壺菌及其高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，進(jìn)一步提高DHA生產(chǎn)率，以利于裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的產(chǎn)業(yè)化。本專利技術(shù)提供一株裂殖壺菌,所述菌株為裂殖壺菌sp. )WZU6961,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 6369。 上述裂殖壺菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，包括如下步驟 1)種子活化a、將所述裂殖壺菌WZU6961轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基的瓊脂平板，加人工海水封蓋，活化，得封蓋海水山、取步驟a得到的封蓋海水轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)；c、取步驟b得到的菌種液，轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)；d、取步驟c得到的菌種液，轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)，得活化菌種； 2)種子培養(yǎng)將步驟I)得到的活化菌種轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基，通入無菌空氣，培養(yǎng)，得種子培養(yǎng)物； 3)發(fā)酵生產(chǎn)將步驟2)得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，通入無菌空氣，流加葡萄糖以維持其濃度在5 30 g/L ;調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速以維持DO值在4% 40%，發(fā)酵60 64 hr放罐，即得。優(yōu)選地，步驟1)&中活化條件201 30°C活化2 6 d，更優(yōu)選為25°C活化4CL優(yōu)選地，步驟l)b中取步驟a得到的封蓋海水以體積比5% 10%的接種量轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20°C 30°C，培養(yǎng)時(shí)間24 48 hr。更優(yōu)選地，步驟I) b中取步驟a得到的封蓋海水以體積比5%的接種量轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200 rpm，培養(yǎng)時(shí)間48 hr。優(yōu)選地，步驟l)c中取步驟b得到的菌種液以體積比5% 15%的接種量轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20°C 30°C，培養(yǎng)時(shí)間24 48 hr。更優(yōu)選地，取步驟b得到的菌種液以體積比10%的接種量轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200 rpm,培養(yǎng)時(shí)間 48 hrο優(yōu)選地，步驟l)d中取步驟c得到的菌種液以體積比5% 15%的接種量轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20°C 30°C，培養(yǎng)時(shí)間24 48 hr。更優(yōu)選地，取步驟c得到的菌種液以體積比10%的接種量轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200 rpm,培養(yǎng)時(shí)間 48 hrο優(yōu)選地，步驟2)中將步驟I)所得活化菌種以體積比5% 15%的接種量轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基，通入無菌空氣，培養(yǎng)溫度20°C 30°C，通氣量5本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一株裂殖壺菌，其特征在于，該菌株為裂殖壺菌（Shizochytrium？sp.）WZU6961，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？NO.？6369。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙肖為，周茂洪，
申請(專利權(quán))人：溫州大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：