本發明專利技術涉及了一種miR-29吸收序列、吸收載體及其用途。本發明專利技術的miR-29吸收載體攜帶從5’至3’依次包含如下元件的表達盒：(a)II型啟動子；(b)指示蛋白編碼序列；(c)miR-29吸收序列，所述吸收序列是4～10次重復的、與miR-29部分互補或完全互補的序列；(d)任選的增強子序列。本發明專利技術還提供了所述吸收載體的應用及包含該載體的藥物組合物。本發明專利技術的miR-29吸收載體可用于預防和治療胞內菌感染導致的炎癥、Th1型反應、結核等疾病。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物技術和醫學領域。具體而言，本專利技術涉及miR-29吸收載體的制備及應用，尤其是miR-29相關疾病中的應用，例如在細菌感染(尤其是胞內菌感染)中的效應、作用機制、實施方法和用途。
技術介紹
Mi croRNA (miRNA)是長約20 24nt、非編碼的微小RNA，它們通過抑制mRNA翻譯或者促進mRNA降解對靶基因進行轉錄后水平的調控(Bartel，D. P.，Cell. 2004,116 281-297)。MiRNA幾乎控制著每一個生物學過程，包括細胞的分化、發育、增殖和凋亡。此夕卜，miRNA表達水平失調與腫瘤等疾病也密切相關(Lu，J.等，Nature. 2005，435 :834-838 ；Li, Q. J.等，Cell. 2007，129 :147-161 ；Cheng, H. Y.等，Neuron. 2007,54 :813-829 ；Ch·ang,T. C.等，Mo I Cell. 2007,26 :745-752 ；He, L.等，Nature. 2005，435 :828-833 ；Care, A.等，Nat Med. 2007，13 :613-618)。在諸多已被廣泛報道的miRNA中，miR-29應該算是一種明星分子，根據已有的50多個miR-29相關的報道中，其作用涉及了腫瘤、血液造血系統疾病、神經系統疾病、呼吸系統疾病、循環系統疾病、風濕病、糖尿病、皮膚病、病毒感染以及骨分化、肌肉分化和肌肉相關疾病等諸多人類重大疾病，這也從一個側面體現出這種miRNA在生理病理過程中發揮的重要作用。此外，即便在腫瘤中，miR-29也體現出截然不同的功能，它既可作為癌基因，亦可被視為抑癌基因。同時，根據計算機預測結果，miR-29可以靶向免疫信號通路中的多個信號分子或者接頭蛋白而參與免疫反應和免疫細胞分化和發育過程的調控。急性髓性白血病病人的外周血淋巴細胞中，miR-29表達下調(Garzon, R.等，Blood. 2009,114 5331-5341)，miR-29b的寡核苷酸模擬物已被證明可靶向凋亡、細胞周期和增殖等多條通路而可用于治療急性髓性白血病(Garzon,R.等，Blood. 2009，114 :6411-6418 ；Garzon,R.等，Blood. 2009，114 :5331-5341)。申請人之前的研究發現細菌感染如李斯特菌、結核分支桿菌感染后，NK和T細胞被活化而其中的miR-29a表達下調，進一步實驗證實，抑制細胞內源性的miR-29a可促進這些細胞產生更多的IFN-Y，而IFN-Y在機體抗胞內菌過程中至關重要。MiRNA吸收載體或者miRNA誘餌載體，能夠通過吸收或扣押內源性的目的miRNA而實現抑制miRNA的功能，miRNA吸收載體的抑制功能遠遠強于化學合成的寡核苷酸抑制劑(Ebert, M. S.和 Sharp, P. A.，RNA. 2010，16 :2043-2050)。并且，相對于化學合成的寡核苷酸抑制劑，miRNA吸收載體在應用時具有很多優勢比如可以制備成病毒載體而在難以轉染的細胞基因高表達，甚至在體內高表達該載體；可以用于制備穩轉細胞系或者轉基因動物模型；可以通過更換細胞特異性的啟動子而使其在某些細胞中特異性表達；其次，由于它可以同時吸收同一家族的miNRA，故比只能吸收完全互補的某一種miRNA的寡核苷酸抑制劑更加強大，更能避免miRNA的功能冗余現象；miRNA吸收載體較化學修飾的miRNA抑制劑價格便宜、穩定性高。IFN-Y是Thl細胞標志性的細胞因子，在抗感染免疫，尤其是抗李斯特菌和抗結核桿菌相關的固有免疫和獲得性免疫中起著至關重要的作用(Schoenborn，J. R.和Wilson, C. B. , Adv Immunol. 2007,96 :41-101)。李斯特菌存在于日常食物中，對免疫缺陷或者免疫耐受的人來說是潛在的危險，因為李斯特菌能誘導敗血癥和腦膜炎，還能引起孕婦的膿毒性流產(Pamer，E.G.，Nat RevImmunol. 2004,4 :812-823)。李斯特菌感染早期的防御主要靠NK細胞分泌的IFN- Y以及隨之活化的巨噬細胞(Pamer, E. G.，Nat Rev Immunol. 2004,4 :812-823)。結核病已是全球最主要的公共衛生問題之一，但有效預防和治療的手段尚待開發(Corbett,E. L.等,Arch Intern Med. 2003,163 :1009-1021)。結核分支桿菌的致死性主要與細菌的增殖、過度的炎癥和繼發的組織損傷相關(North，R. J.和Jung，Y. J.，Annu RevImmunol. 2004，22 :599-623 ；Dorhoi,A.等，J Exp Med. 2010，207 :777-792)，而宿主抗結核 菌的免疫反應主要靠Thl細胞(Mogues, T.等，J Exp Med. 2001，193 :271-280)。因此，結核菌持續性感染的機制以及如何有效激活免疫系統以抵抗結核菌的研究，將有助于設計、應用結核菌的防治策略。在多個動物模型以及人類疾病中已充分證實Thl細胞及其分泌的IFN-Y在抗結核分支桿菌感染過程中起主要作用(Redford, P. S.等，Eur J Immunol. 2010,40 2200-2210)。另一方面，IFN-Y也參與了某些免疫疾病的病理過程。因此，探討調控IFN-Y的機制，可以幫助我們了解怎樣更好地保護機體抗胞內病原菌感染，以及限制過度炎癥反應引起的組織損傷。本領域中迫切需要開發出有效治療或預防miR-29相關疾病(尤其是感染或結核病等)的新藥物。
技術實現思路
本專利技術的目的之一正是提供了一種miR-29吸收序列或載體，及其在有效抵抗細菌感染、預防和治療胞內菌感染性疾病中的新用途。本專利技術的另一目的是提供這種新型miR-29新型載體的作用原理及在抗胞內菌感染過程中的免疫學原理。本專利技術的又一目的是提供了這種新型吸收載體在抗細菌感染中的用途和實施策略，特別是應用于胞內菌感染導致的炎癥、Thl型反應、結核等疾病的預防和治療。本專利技術提供的miR-29吸收載體可以促進胞內菌感染后IFN-Y的產生，減少肝臟、肺臟、脾臟等臟器中細菌的殘留量，提高機體的存活率。在本專利技術的第一方面中，提供了一種miR-29吸收載體，其攜帶從5’至3’依次包含如下元件的表達盒(a) II型啟動子；(b)指示蛋白編碼序列；(c)miR-29吸收序列，所述吸收序列是4 10次重復的、與miR-29部分互補或完全互補的序列；(d)任選的增強子序列。在一優選例中，miR-29吸收載體中的表達盒自5’至3’依次為UBC啟動子、eGFP指不蛋白及其在終止碼后插入的miR-29吸收序列。在本專利技術的一個實施方式中，所述II型啟動子優選UBC、CAG、PGK、CMV啟動子。在一個優選例中，所述UBC啟動子優選為Human Ubiquitin C序列(SEQ ID NO:18)或其同源序列。在另一個優選例中,所述啟動子是細胞特異性啟動子或廣泛表達的啟動子。在本專利技術的另一個實施方式中，所述指示蛋白選自熒光蛋白、螢光素酶或者表達標簽。在一個優選例中，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種miR？29吸收載體，其攜帶從5’至3’依次包含如下元件的表達盒：(a)II型啟動子；(b)指示蛋白編碼序列；以及(c)miR？29吸收序列，所述吸收序列是4～10次重復的、與miR？29部分互補或完全互補的序列；(d)任選的增強子序列。
【技術特征摘要】
1.一種miR-29吸收載體，其攜帶從5’至3’依次包含如下元件的表達盒 (a)II型啟動子； (b)指示蛋白編碼序列；以及 (c)miR-29吸收序列，所述吸收序列是4 10次重復的、與miR-29部分互補或完全互補的序列； (d)任選的增強子序列。2.如權利要求I所述的miR-29吸收載體，其特征在于，所述II型啟動子優選UBC、CAG、PGK、CMV 啟動子。3.如權利要求I所述的miR-29吸收載體，其特征在于，所述指示蛋白選自熒光蛋白、螢光素酶或者表達標簽。4.如權利要求I所述的miR-29吸收載體，其特征在于，所述吸收序列與miR-29的互補比例為78% 84%。5.如權利要求I所述的miRNA吸收載體，其特征在于，所述miR-29吸收序列選自下組如SEQ ID NO :3所示的序列；由SEQ ID NO :3所示序列經過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸、且具有預防或治療miR-29過表達相關疾病和/或征狀的活性的序列；或它們的互補序列。6.如權利要求I所...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曹雪濤，馬烽，李楠，徐勝，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第二軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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