本發(fā)明專利技術(shù)涉及表達NY-ESO-1重組恥垢分枝桿菌的制備及應用。具體而言，本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種用于重組腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-1蛋白表達的質(zhì)粒，其包含：β-半乳糖苷酶信號肽編碼序列或β-半乳糖苷酶編碼序列；和NY-ESO-1編碼序列。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了包含本發(fā)明專利技術(shù)質(zhì)粒的重組恥垢分枝桿菌、組合物及它們的用途。采用本發(fā)明專利技術(shù)的重組恥垢分枝桿菌可對表達NY-ESO-1的腫瘤細胞可產(chǎn)生顯著殺傷效應，由此可用于這些腫瘤的有效預防和/或治療。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物學和基因工程學領(lǐng)域，具體而言涉及一種表達腫瘤/睪丸抗原NY-ES0-1的恥垢分枝桿菌、其制備及該重組恥垢分枝桿菌在免疫治療腫瘤中的應用。
技術(shù)介紹
恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)是一種非典型的分枝桿菌,與典型的分枝桿菌BCG相比，恥垢分枝桿菌生長快速，對人、小鼠、豚鼠等動物均無致病性，作為一種細菌疫苗載體有著廣闊的應用前景。BCG作為淺表性膀胱癌的免疫輔助治療已有很長的歷史，但活的BCG仍存在毒性，有可能引起結(jié)核桿菌的感染，尤其對免疫缺陷型的病人存在很大的危害。初步研究表明無細胞恥垢分枝桿菌疫苗具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，對結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染的豚鼠具有·明顯保護效果，并具有較高安全性，目前已進入II期臨床研究[I]。此外，恥垢分枝桿菌單位時間內(nèi)的分泌型蛋白產(chǎn)量是BCG的50-100倍。因此，以恥垢分枝桿菌作為一種低成本且有效的疫苗載體表達外源抗原已成為目前疫苗研究中的熱點。Jae-Sung Yu等[2]研究了表達HIV-1蛋白的重組恥垢分枝桿菌對小鼠的免疫作用，結(jié)果表明經(jīng)重組恥垢分枝桿菌免疫的小鼠成功產(chǎn)生了 HIV抗體及特異的T淋巴細胞反應及IFN-Y。Lin Lu等[3]構(gòu)建了表達人幽門螺桿菌26K外膜蛋白(0MP6)的重組恥垢分枝桿菌，經(jīng)該重組恥垢分枝桿菌免疫后的小鼠對幽門螺桿菌的感染產(chǎn)生了明顯的免疫保護作用，其腸道中幽門螺桿菌菌落急劇減少，由此該作者認為該重組恥垢分枝桿菌可作為一種低成本的、有效的針對幽門螺桿菌的聯(lián)合疫苗。NY-ES0-1抗原是腫瘤-睪丸抗原家族中的重要成員，在多種腫瘤細胞上表達，包括黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌和膀胱癌，并且是迄今發(fā)現(xiàn)的最具免疫原性的腫瘤抗原之一。NY-ES0-1抗原可在NY-ES0-1表達陽性的腫瘤患者體內(nèi)引起自發(fā)性體液免疫反應和特異性T細胞免疫反應[4]，因此該抗原被認為是目前最好的腫瘤候選疫苗之一，在腫瘤免疫治療中頗具發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳埃槍Y-ES0-1的多肽疫苗大多是基于它的不同表位(如P156-167、pl57-160、pl57-170)，人工合成這些抗原肽或者將這些抗原肽與伴侶蛋白(如HSP)融合作為疫苗進行研究。然而，本領(lǐng)域中仍然迫切需要開發(fā)出更有效的NY-ES0-1的多肽疫苗，以獲得更為顯著的免疫效果。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的之一是提供帶有NY-ES0-1基因的分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達質(zhì)粒，其可將NY-ES0-1分別與β -半乳糖苷酶信號肽及全序列融合表達。本專利技術(shù)的另一個目的是提供一種能將腫瘤/睪丸抗原NY-ES0-1錨定表達在細胞壁或細胞膜上的恥垢分枝桿菌工程菌株。本專利技術(shù)的再一個目的是提供了該工程菌株在腫瘤免疫治療中的應用。采用本專利技術(shù)重組恥垢分枝桿菌免疫對象，可在對象體內(nèi)提高抗原NY-ES0-1的提呈及誘發(fā)機體產(chǎn)生細胞、體液免疫反應，進而殺傷表達NY-ES0-1的腫瘤細胞，起到預防和/或治療腫瘤的效果。在本專利技術(shù)的第一方面中，提供了一種用于重組腫瘤-睪丸抗原NY-ES0-1蛋白表達的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含(a) β -半乳糖苷酶信號肽編碼序列或β -半乳糖苷酶編碼序列；和(b) NY-ES0-1 編碼序列。在本專利技術(shù)的一個實施方式中，所述重組NY-ES0-1蛋白是β -半乳糖苷酶信號肽序 列與NY-ES0-1的融合蛋白、或半乳糖苷酶全長序列與NY-ES0-1的融合蛋白。在一個優(yōu)選例中，所述融合蛋白定位于重組恥垢分枝桿菌的細胞壁或細胞膜上，優(yōu)選細胞壁上。在另一個優(yōu)選例中，所述融合蛋白中的β -半乳糖苷酶信號肽序列或全長序列與NY-ES0-1直接相連或通過連接肽序列相連，優(yōu)選所述連接肽的長度為I 30個氨基酸殘基，優(yōu)選5 25個氨基酸殘基，更優(yōu)選10 23個氨基酸殘基。在另一個優(yōu)選例中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :8所示的序列，優(yōu)選為SEQ ID NO :6或SEQ ID NO 8所示的序列。在本專利技術(shù)的另一個實施方式中，所述β -半乳糖苷酶信號肽編碼序列選自如下所示的序列=GenBank號L25634. I [14]、SEQ ID NO :3所示序列編碼的多肽、或它們的保守性變異蛋白或其活性片段、或其中的氨基酸序列經(jīng)過1-20個(優(yōu)選1-10個，更優(yōu)選1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且指導β -半乳糖苷酶定位于細胞壁或細胞膜上的信號序列；所述β -半乳糖苷酶編碼序列選擇=GenBank號L25634. I、SEQ ID NO 4所示序列、其同源序列或在嚴格條件下可與該序列雜交的序列；與所述編碼核酸的序列具有至少75%、80%、90%、95%、98%或更高相同性的多核苷酸；所述NY-ES0-1編碼序列選自如下所示的序列GenBank號U87459. I中所示序列、SEQ ID NO :1所示的序列、其同源序列或在嚴格條件下可與該序列雜交的序列；與所述編碼核酸的序列具有至少75%、80%、90%、95%、98%或更高相同性的多核苷酸序列。在一個優(yōu)選例中，所述腫瘤-睪丸抗原NY-ES0-1來源于人、大鼠、小鼠的睪丸組織或腫瘤組織，優(yōu)選來源于人睪丸組織。在本專利技術(shù)的另一個實施方式中，所述質(zhì)粒包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7所示的序列。在本專利技術(shù)的另一個實施方式中，所述質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，其可在大腸桿菌、恥垢分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌中復制擴增。在一個優(yōu)選例中，所述重組質(zhì)粒是分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達質(zhì)粒PLA73NY或PLA71NY，優(yōu)選 pLA71NY。在本專利技術(shù)的另一個實施方式中，所述用于重組NY-ES0-1蛋白表達的質(zhì)粒是基于選自下組的質(zhì)粒構(gòu)建的pLA71、pLA73、pJH152或pJEM17在一個優(yōu)選例中，所述用于重組NY-ES0-1蛋白表達的質(zhì)粒是基于pLA71質(zhì)粒構(gòu)建的。在本專利技術(shù)的第二方面中，提供了一種重組恥垢分枝桿菌，其包含本專利技術(shù)的質(zhì)粒。在一個優(yōu)選例中，所述重組恥垢分枝桿菌是基于選自下組的分枝桿菌構(gòu)建的恥垢分枝桿菌mc2155菌株、結(jié)核分枝桿菌,優(yōu)選恥垢分枝桿菌mc2155菌株。 在本專利技術(shù)的一個實施方式中，其表達重組的NY-ES0-1蛋白，并將該重組的蛋白定位于細胞壁。在一個優(yōu)選例中，所述重組NY-ES0-1蛋白是β -半乳糖苷酶信號肽序列或全長序列與NY-ES0-1的融合蛋白。在本專利技術(shù)的第三方面中，提供了一種免疫組合物，所述組合物包含(i)本專利技術(shù)的質(zhì)粒、本專利技術(shù)的重組恥垢分枝桿菌或其裂解物或細胞壁部分；和(ii)免疫學上可接受的載體和/或佐劑。在一個優(yōu)選例中，所述免疫組合物還包含NY-ES0-1抗原。在另一個優(yōu)選例中，所述免疫組合物用于預防和/或治療NY-ES0-1陽性腫瘤，所述腫瘤包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌，優(yōu)選膀胱癌或前列腺癌。在另一個優(yōu)選例中,所述重組恥垢分枝桿菌是活菌體、減活菌體或滅活菌體。在本專利技術(shù)的第四方面中，提供了本專利技術(shù)的質(zhì)粒、本專利技術(shù)的重組恥垢分枝桿菌或其裂解物或細胞壁部分在制備用于預防和/或治療NY-ES0-1陽性腫瘤的藥物組合物或疫苗中的用途。在一個優(yōu)選例中，所述NY-ES0-1陽性腫瘤選自黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌，優(yōu)選膀胱癌或前列腺癌。在本專利技術(shù)的本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種用于重組腫瘤？睪丸抗原NY？ESO？1蛋白表達的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含：(a)β？半乳糖苷酶信號肽編碼序列或β？半乳糖苷酶編碼序列；和(b)NY？ESO？1編碼序列。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于重組腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-I蛋白表達的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含 (a)β -半乳糖苷酶信號肽編碼序列或β -半乳糖苷酶編碼序列；和 (b)NY-ES0-1編碼序列。2.如權(quán)利要求I所述的質(zhì)粒，其特征在于，所述重組NY-ES0-1蛋白是β_半乳糖苷酶信號肽序列與NY-ES0-1的融合蛋白、或半乳糖苷酶全長序列與NY-ES0-1的融合蛋白。3.如權(quán)利要求I所述的質(zhì)粒，其特征在于， 所述β-半乳糖苷酶信號肽編碼序列選自如下所示的序列=GenBank號L25634. USEQID NO :3所示序列編碼的多肽、或它們的保守性變異蛋白或其活性片段、或其中的氨基酸序列經(jīng)過1-20個(優(yōu)選1-10個，更優(yōu)選1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且指導β_半乳糖苷酶定位于細胞壁或細胞膜上的信號序列； 所述半乳糖苷酶編碼序列選擇=GenBank號L25634. USEQ ID NO :4所示序列、其同源序列或在嚴格條件下可與該序列雜交的序列；與所述編碼核酸的序列具有至少75%、80%、90%、95%、98%或更高相同性的多核苷酸； 所述NY-ES0-1編碼序列選自如下所示的序列GenBank號U87459. I中所示序列、SEQID NO :1所示的序列、其同源序列或在嚴格條件下可與該序列雜交的序列；與所述編碼核酸的序列具有至少75%、80%、90%...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳丹丹，徐帆洪，高丹，
申請(專利權(quán))人：上海生物制品研究所有限責任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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