本發明專利技術涉及同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP。它是在載體pIRES2-EGFP的基礎上，經PCR反應獲得缺失IRES和EGFP序列的載體骨架pΔSG，構建其T載體克隆psT-ΔSG，酶切后與同步酶切的、攜帶附加優化MCS序列的熒光蛋白報告基因DsRed2、EGFP進行連接、亞克隆而得。將待分析目的DNA序列定向克隆入pDsRed2-MCS-EGFP的MCS區，獲得的重組質粒轉染相應宿主細胞，DsRed2的本底表達指示轉染效率，EGFP的表達有賴MCS區目的DNA序列的活性，其表達與否及表達量的多少，皆作為指征目的DNA序列是否具有相應生物活性及其高低。優化的MCS序列適合更廣泛的基因克隆操作；DsRed2和EGFP表達的檢測時效范圍寬，且相互獨立、互為表征，成像效果清晰、鮮明，使實驗操作更簡便，結果更具說服力。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體，是用于鑒定外源目的DNA片段是否具有啟動轉錄或起始翻譯功能的載體質粒。
技術介紹
含有篩選標記的轉基因載體在基因工程中具有廣泛的用途。常見轉基因載體包含有一個或多個篩選標記或報告基因，以方便對插入外源核苷酸片段重組質粒的篩選和鑒定。其中熒光蛋白基因在活細胞中的表達產物具有生物活性穩定、信號特異性強、有效活性維持時間長、方便檢測和對外源目的基因表達活性干擾小等特點，所以常利用熒光蛋白基因的表達來研究外源核苷酸片段的功能。通常情況下，同一報告基因載體中僅含有一個熒 光蛋白基因，將目的DNA片段克隆到熒光蛋白基因的N端或C端，構建的重組質粒轉染相應宿主細胞，通過檢測熒光蛋白的表達即可判定目的核酸片段是否具有相應功能，但難以同步反映重組報告基因質粒的轉染效率和判定目的DNA的生物功能。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP，2012年07月06日送藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，分類命名大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏號 CGMCC 6320。本專利技術構建同向串聯共表達雙色熒光蛋白的報告基因載體所采用的技術方案是利用基因克隆技術，在親本載體PIRES2-EGFP啟動子pCMV后的Bgl II位點與SV40polyA序列之間置換入如下DNA序列自5'至3'方向依次插入紅色熒光蛋白基因DsRed2、優化組合的多克隆酶切位點MCS(包括Sal I,Spe I,Sca I,Pvu I、Nhe I,Mlu I,EcoR I,Xba I,BamHI、Sac II, Sac I, Sma I和EcoR V，其中Nhe I為非單克隆位點)、綠色熒光蛋白基因EGFP和Xho I位點序列(如SEQN0. I中的第609-2085nt)，獲得如SEQN0. I (第l_5408nt)所示核苷酸序列的同向串聯共表達雙色熒光蛋白的新型報告基因載體質粒pDsRed2-MCS-EGFP。所述同向串聯共表達雙色熒光蛋白的報告基因載體的DNA分子也屬于本專利技術的保護范圍。含有所述載體分子、所述重組報告基因載體的轉基因重組菌或細胞也屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術的同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體具備經直接酶切、連接構建插入目的DNA的重組報告基因質粒及轉染細胞等簡單操作，就可以用于分析和鑒定插入目的DNA序列生物活性的功用；由pCMV啟動轉錄的多順反子mRNA中，上游紅色熒光蛋白的表達指示轉染效率，下游綠色熒光蛋白的表達與否及其產量反映目的DNA序列是否具有相應生物活性及其活性高低。附圖說明圖I同向串聯共表達雙熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP的構建圖譜。圖2載體骨架P Λ SG的PCR擴增與克隆鑒定電泳圖譜。圖3構建同向串聯共表達雙熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP的電泳圖-i'TfeP曰。圖4重組報告基因質粒PDsRed2-LTR-EGFP的酶切鑒定電泳圖譜。圖5各質粒轉染CHO細胞的熒光檢測結果。 具體實施例方式下述實施例中如無特殊說明，所用方法均為常規基因克隆方法，所用試劑均可經商業途徑購得。實施例I.構建同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS_EGFP(I)載體骨架P Λ SG的PCR擴增與克隆在載體pIRES2-EGFP(PT3267-5，Clontech)的基礎上，設計含有linker序列的引物P Λ SG F、P Λ SG R擴增缺失IRES和EGFP基因片段的載體骨架ρ Λ SG (包括pCMV、PUCori、Kan/Neo、SV40polyA 功能或基因序列)。P ASG F 5/ -CGCCTCGAGTCTAGATCATAATCAGCCATACC-3'，(含有 XhoI、XbaI 的識別位點)；ρ ASG R 5/ -CCGGATATCGAATTCGAAGCTTGAGC-3'，(含有 EcoR I、EcoR V 的識別位點)。25 μ I 反應體系的組成是雙蒸水 15. O μ 1，Ex Taq IOXBuffer 2. 5 μ 1，dNTPs2.O μ I,MgCl2L 5 μ l，pASG Fl. O μ l，pASG R I. O μ l，pIRES2_EGFPTE 溶液 I. O μ I,ExTaq1.O μ I。PCR擴增條件是 95°C 5min ；95°C 50sec,55°C 50sec,72°C 5min，共 32 個循環；最后經72°C IOmin充分延伸后冷卻至4°C保存。PCR產物經O. 8 %瓊脂糖凝膠電泳分離大小為3975bp的ρ Λ SG PCR產物，切膠同收后與pMD 18-TSimple Vector連接構建重組克隆psT- Δ SG。經常規轉化經CaCl2制備的DH5a感受態細胞，涂布含Ampicillin的LB固體平板，37°C過夜培養。到時選取平板上優勢抗性生長的單菌落，用引物ρ Λ SG F, ρ Δ SG R做菌落PCR檢測。初步檢測為陽性的克隆菌落經挑菌，在含Ampicillin的LB液體培養基中過夜擴增后送商業公司測序。提取結果正確的克隆樣品的質粒進行EcoR I、XhoI雙酶切和Bgl II單酶切反應，鑒定載體質粒PsT- Δ SG。psT- Δ SG經EcoRI和XhoI雙酶切出2710bp和3957bp兩條帶，經Bgl II單酶切出6667bp的一條帶?？寺?、鑒定psT-Λ SG的電泳結果如圖2所示。圖2中，I.擴增ρ Λ SG的PCR產物、2.菌落PCR鑒定ρΛ SG的擴增結果、3. psT-Λ SG經EcoR I和XhoI雙酶切產物、4. psT-Λ SG經 Bgl II 單酶切產物、5. DNA MarkerDL15000.(2)構建同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體質粒pDsRed2-MCS-EGFP在載體pDsRed2-Cl(PT3603_5，Clontech)的基礎上，設計引物 DsRed2F、DsRed2R擴增紅色熒光蛋白基因DsRed2(723nt)。DsRed2F :5'-CAGATCTACCATGGCCTCCTCCGAGAAC-3'，(含有 Bgl II 識別位點);DsRed2R 5'-GAATTCACGCGTGCTAGCGATCGAGTACTAGTCGACTACAGGAACAGGTGGTGGCGGC-3'，(含有Sal I、Spe I、ScaI、PvuI、獨§1、MluI和EcoRI識別位點，其中NhsL不是單克降酶切位點)。PCR 反應體系是雙蒸水 15·0μ 1，ExTaq 10XBuffer2. 5 μ I, dNTPs 2. Ομ I,MgCl2L 5 μ I, DsRed2F I. O μ I, DsRed2R I. O μ 1，pDsRed2_ClTE 溶液 1.0 μ 1，Ex TaqI. O μ I。PCR 擴增條件是 95°C 5min ；95°C 50sec, 55°C 50sec, 72V 50sec，共 32 個循環；最后經72°C IOmin充分延伸后冷卻本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種DNA分子，其特征是：經優化MCS序列串聯的可同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體質粒pDsRed2？MCS？EGFP，具有SEQ？NO.1中第609？2085nt的DNA序列。
【技術特征摘要】
1.一種DNA分子，其特征是經優化MCS序列串聯的可同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體質粒pDsRed2-MCS-EGFP，具有SEQ NO. I中第609_2085nt的DNA序列。2.含有權利要求I所述報告基因載體質粒的構建方法。3.根據權利要求2所述的報告基因載體質粒，其特征在于pCMV下游連接有優化MCS串聯表達的雙色熒光蛋白報告基因序列DsRed2-MCS-...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王玉，于愛蓮，姜世金，施魯笛，
申請(專利權)人：泰山醫學院，
類型：發明
國別省市：
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