一種極端環境原油降解功能菌的分離篩選方法技術

一種極端環境原油降解菌的分離篩選方法，解決了現有原油降解菌分離篩選方法存在的操作過程復雜、分離效率低、分離所得微生物效果差的缺點。其技術特點是一、采用無機鹽培養基從極端環境污染土壤中富集原油降解菌；二、將所得富集菌液梯度稀釋后，進行間歇試驗考察原油降解情況；三、采用DGGE技術分析各稀釋度菌液的群落組成，從而得到原油去除效果與富集菌液相類似、組成最為簡單的菌液，即為高效原油降解功能菌。該方法具有簡單、高效、快速的特點，分離所得原油降解菌通常具有較高的去除效果。

【技術實現步驟摘要】
所屬領域本專利技術涉及到一種極端環境原油降解菌的分離篩選方法。該方法是用含原油無機鹽培養基從極端環境污染土壤中富集原油降解菌；再將所得富集菌液梯度稀釋后，進行間歇試驗考察原油降解情況；然后采用DGGE技術分析各稀釋度菌液的群落組成，從而得原油去除效果與富集菌液相類似、組成最為簡單的菌液，即為高效原油降解功能菌
技術介紹
上世紀五十年代以來，石油在世界能源構成中的比重超過煤炭，成為世界第一能源。但它的大規模應用卻給環境造成了極大的危害。據估計全世界每年約有I09t石油及其產品通過各種途徑進入地下水、地表水及土壤中。石油土壤污染不僅改變土壤理化特性，破壞土壤結構，還會惡化土壤微生物的生境，削減土壤微生物種類與數量，降低微生物活性。水體的石油污染將干擾污染水域生物群落的正常生理、生化活動，破壞化學信息聯系，使生物的生長和繁殖受到嚴重損害，給生態系統帶來嚴重危害。與物理化學方法相比，生物法的石油污染(土壤或水污染)處理具有運行操作成本低、處理效率高、且無二次污染的優點而倍受青睞。作為生物法處理的“主體”高效原油降解微生物的獲得則是生物法成功的關鍵。由于石油成分比較復雜，單一菌株往往很難達到理想的原油降解效果。目前的研究中所采用的分離方法、尤其是極端環境條件下的分離方法是針對不同的原油組分分別篩選特定單一菌株，然后將所有菌株復配構成復配體系。此種方法不僅操作過程復雜繁瑣、工作量大，所得的微生物對原油的去除效果往往很不理想。針對目前極端環境原油降解菌分離篩選過程存在的以上不足，本專利技術提出了一種
技術實現思路
本專利技術的目的就在于避免上述現有技術的不足之處而提供了一種極端環境原油降解菌的分離篩選方法，該方法是一種簡單、高效的原油降解功能菌分離篩選方法，它避免了冗雜的操作程序，具有工作量小，篩選所得微生物原油去除效率高等特點。他的技術原理是由于微生物具有廣泛的適應性，較強的微生物誘導酶機制和旺盛的代謝能力，極端環境下長期受原油污染的土壤往往是高效原油降解菌的聚集地。常規微生物分離培養技術，采用富集培養基對土壤中原油降解菌進行富集，使得富集得到的微生物組成較為復雜，對于進一步研究和應用帶來諸多不便。因此，本研究中采用梯度稀釋的方式，對所得的富集菌液進行稀釋，然后進行間歇實驗進一步驗證各稀釋度的原油降解特性，同時結合分子生物學技術分析各稀釋度的微生物群落組成。在間歇實驗和微生物群落結構分析的基礎上，得到組成最為簡單、原油去除效果與富集菌液相似的最低稀釋度菌液，即為高效原油降解功能菌群。具體
技術實現思路
如下(一 )采用含油無機鹽培養基從極端環境污染土壤中富集原油降解菌；( 二)將所得富集菌液進行梯度稀釋，間歇試驗考察原油降解情況；(三)采用DGGE技術分析各稀釋度菌液的群落組成，從而得到稀釋度最低、原油去除效果與富集菌液相類似、組成最為簡單的菌液，即為高效原油降解功能菌。本專利技術采用分子生物學技術與常規微生物分離篩選相結合的方式，針對目前極端環境下原油降解菌分離篩選操作復雜、工作量大、所篩選的微生物降解效果不理想的問題，創造性提出了一種簡單、高效的原油降解功能菌的分離篩選方法。該方法避免了常規分離培養方法中針對不同的原油組分分別篩選特定單一菌株后將所有菌株復配構成復配體系的不足，同時也可以避免一些不可單一培養(可以菌群形式培養)微生物的丟失，具有簡單、高效、快速、分離所得原油降解菌具有較高的去除效果等優點。附圖說明附圖I是各稀釋度菌液原油降解情況 附圖2是各稀釋度菌液DGGE譜圖附圖3是所篩選原油降解菌在油濃度10g/L條件下不同溫度時原油降解效果具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本專利技術進一步說明。本實施方式中高效原油降解功能菌的分離篩選方法是按下述步驟進行的一、將5g克拉瑪依地區(高溫干旱環境)石油污染土壤放入IOOml含10g/L原油的無機鹽培養基培養，于45°C，140-170rpm的搖床中培養5天后，取富集液5mL接種相同新鮮培養基，相同條件下培養5天，如此連續富集培養3次，將菌液保種于20%甘油中，_80°C低溫冰箱保存。其中無機鹽培養基配制方法NaHPO4O. 6g，KH2PO4O. 2g，NaN034. 0g,CaCl2O. Olg, FeSO4O. 01，MgSO4O. 3g，酵母膏 0. 5g，蒸餾水 lOOOmL，調節 pH 至 7· 2。二、將富集后的混合菌用無菌水梯度稀釋，取稀釋度為10'10'10'10'1(Γ9五個個稀釋樣于250ml三角瓶中，在45°C、165rpm的旋轉搖床上培養，培養5d后，測定培養液中的原油殘留量，每一稀釋度樣品重復3次，計算平均降解率(間歇實驗內容)，結果如圖I所示，其中富集菌液、10'10_3、10_5、10_7四個稀釋度原油降解效果較好在40% -60%之間，而10_9稀釋度菌液幾乎沒有降解效果。三、同時將釋度為10'10'10'10'IO-9菌液進行DGGE分析(如圖2)，DGGE圖譜中各條帶分析見表1，可以看出DGGE圖譜中泳道I (富集菌液)到泳道4 (稀釋度為10_5)微生物組成較豐富，而泳道6 (稀釋度為10_9)微生物條帶最少，泳道5 (稀釋度為10_7)介于二者之間，結合間歇實驗結果，10_9稀釋度(泳道6)菌液幾乎沒有降解效果，而10_7稀釋度(泳道5)原油降解效果與富集菌液相類似，因此確定組成最為簡單的10_7稀釋度菌液為原油降解功能菌(命名為KL8-2),且其主要由7種Rhizobiales sp. , Pseudomonassp·,Brucella sp. , Bacillus sp. ,Rhodococcus sp. ,Microbacterium sp.和 Roseomonassp.菌構成。四、在油濃度為10g/L的無機鹽培養基中，按5%接種量接種功能菌KL8-2，分在30-70°C、160rpm條件下培養5天后，測得殘余原油量，考察所得功能菌對溫度的耐受性。如圖3所示，原油降解菌KL8-2對溫度具有良好的耐受性，溫度在40-60°C，原油降解率在45%以上。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種極端環境原油降解菌的分離篩選方法，包括如下步驟(一)采用含原油無機鹽培養基從極端環境污染土壤中富集原油降解菌；(二)將所得富集菌液梯度稀釋后，進行間歇試驗考察原油降解情況；(三)采用DGGE技術分析各稀釋度菌液的群落組成，從而得原油去除效果與富集菌液相類似、組成最為簡單的菌液，即為高效原油降解功能菌，其特征在于具體富集的步驟是將5g克拉瑪依地區(高溫干旱環境)石油污染土壤放入100m1含10g/L原油的無機鹽培養基培養，于45℃，140？170rpm的搖床中進行原油降解菌培養5天后，取富集液5mL接種相同新鮮培養基，相同條件下培養5天，如此連續富集培養3次，將菌液保種于20％甘油中，？80℃低溫冰箱保存。

【技術特征摘要】
1.一種極端環境原油降解菌的分離篩選方法，包括如下步驟(一)采用含原油無機鹽培養基從極端環境污染土壤中富集原油降解菌；(二)將所得富集菌液梯度稀釋后，進行間歇試驗考察原油降解情況；(三)采用DGGE技術分析各稀釋度菌液的群落組成，從而得原油去除效果與富集菌液相類似、組成最為簡單的菌液，即為高效原油降解功能菌，其特征在于具體富集的步驟是將5g克拉瑪依地區(高溫干旱環境)石油污染土壤放入IOOml含IOg/L原油的無機鹽培養基培養，于45°C，140-170rpm的搖床中進行原油降解菌培養5天后，取富集液5mL接種相同新鮮...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙東風，劉春爽，張云波，劉其友，李政，吳文華，
申請(專利權)人：中國石油天然氣集團公司，中國石油大學華東，
類型：發明
國別省市：