本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種如SEQ?NO.1所示花鰻鱺生長激素及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)首次通過對花鰻鱺的生長激素基因進行克隆測序后進行相關(guān)分子生物學(xué)分析，通過基因表達得到的花鰻鱺生長激素能夠有效促進花鰻鱺魚苗的生長，解決了養(yǎng)殖過程中花鰻鱺苗種生長速度緩慢的問題，為花鰻鱺人工養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展提供新的解決方法。本發(fā)明專利技術(shù)提供的花鰻鱺生長激素有利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用，可用于花鰻鱺的規(guī)模化養(yǎng)殖，具有較好的經(jīng)濟效益。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于水產(chǎn)學(xué)基因工程
，特別涉及一種花鰻鱺生長激素及其編碼基因和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
生長激素(Growth hormone, GH)是包括魚類在內(nèi)的所有脊椎動物腦垂體分泌的一種單鏈多肽激素。GH是一種具有廣泛生理功能的生長調(diào)節(jié)素，能影響幾乎所有的組織類型和細胞，包括免疫組織、腦組織及造血系統(tǒng)，其主要生理作用是刺激骨、軟骨細胞的生長和分化，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖和脂肪的代謝。GH發(fā)揮作用主要通過兩種方式一是誘導(dǎo)肝細胞等產(chǎn)生GH介質(zhì)(又稱胰島素樣生長因子，IGFs)，再由IGFs間接起作用；二是直接作用于靶細胞產(chǎn)生生理效應(yīng)。無論哪一種方式GH都需要首先與GH結(jié)合蛋白結(jié)合，通過GH結(jié)合蛋白與細 胞表面特異性受體結(jié)合，再由受體介導(dǎo)產(chǎn)生生物效應(yīng)。目前對GH的研究主要集中于鳥類和哺乳類，近年來對魚類的研究也日趨增多。GH能增強食欲、提高飼料轉(zhuǎn)化率、加速魚體生長發(fā)育，被認為是最有效的促進生長因子。然而，魚類體內(nèi)天然激素含量極低，分離純化比較困難，成本較高，不可能大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。近年來，基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展和完善為大量生產(chǎn)廉價的魚類激素提供了保證。生長激素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有重大作用，越來越得到人們的重視。魚類生長激素基因的克隆及表達無論在科學(xué)研究還是生產(chǎn)應(yīng)用上都有重要意義。花鰻鱺在分類學(xué)上隸屬于硬骨魚綱、鰻鱺目、鰻鱺科、鰻鱺屬，廣泛分布于全球熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，是鰻鱺屬魚類中分布最廣的種類。我國的福建、廣東、臺灣、海南等省的河流海域可見到花鰻鱺，但由于人為捕撈嚴重及江河中修建水利水電工程對河道的破壞，花鰻鱺的自然資源顯著下降，已被列為我國二級保護動物。花鰻鱺品味鮮美，其肉和肝的維生素A含量特別高，營養(yǎng)豐富，具有相當高的營養(yǎng)價值，但價格昂貴，歷來被視為上等滋補食品，稱之為“水中人參”。近年來，在我國養(yǎng)殖花鰻鱺已經(jīng)逐步形成規(guī)模化，但是花鰻鱺的養(yǎng)殖者普遍認為該魚野性大，馴化難，低齡階段不易長大；逃走能力特別強，可以跳躍式逃走；養(yǎng)殖過程中苗種生長速度是制約其發(fā)展的主要原因。在工廠化養(yǎng)殖花鰻鱺的生產(chǎn)周期中，II齡前苗種的生長速度較慢，II齡后生長速度才顯著提高，這種現(xiàn)象一直困擾養(yǎng)殖戶及企業(yè)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種花鰻鱺生長激素。本專利技術(shù)的另一目的在于提供上述花鰻鱺生長激素的編碼基因。本專利技術(shù)的再一目的在于提供所述的花鰻鱺生長激素的應(yīng)用。本專利技術(shù)的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種花鰻鱺生長激素，其氨基酸序列如SEQN0. I 所示；編碼所述的花鰻鱺生長激素的核苷酸序列如SEQN0. 2所示；所述的花鰻鱺生長激素可應(yīng)用于花鰻鱺的養(yǎng)殖，特別是花鰻鱺的規(guī)模化養(yǎng)殖。本專利技術(shù)相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果本專利技術(shù)首次通過對花鰻鱺的GH基因進行克隆、測序及分析，并進行表達獲得同源生長激素，將其應(yīng)用于解決養(yǎng)殖生產(chǎn)中出現(xiàn)的問題，實現(xiàn)產(chǎn)學(xué)研結(jié)合，為花鰻鱺人工養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展提供新的理論依據(jù)。本專利技術(shù)提供的花鰻鱺生長激素有利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用，具有較好的經(jīng)濟效益。附圖說明圖I是GH cDNA序列擴增凝膠電泳圖，其中M為Marker，1、2為目的片段。圖2是瓊脂糖凝膠電泳檢測菌液PCR結(jié)果圖，其中編號1-5為菌液鑒定PCR產(chǎn)物;M 為 Marker DL2000。·圖3是15wt%SDS_PAGE電泳檢測純化結(jié)果圖，其中A為Marker，B為空載對照，C為未加IPTG誘導(dǎo)的蛋白，D為總蛋白，E為上清液，F(xiàn)為沉淀物，G為最初洗脫物，H為洗脫液I，I為洗脫液II，J為洗脫液III。圖4是同源生長激素浸泡花鰻鱺苗的生長情況比較圖。圖5是同源生長激素浸泡花鰻鱺苗的增重率比較圖。圖6是同源生長激素浸泡花鰻鱺苗的特定生長率比較圖。具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本專利技術(shù)作進一步詳細的描述，但本專利技術(shù)的實施方式不限于此。實施例I(一)花鰻鱺生長激素編碼基因根據(jù)已知魚類GH基因的保守序列，設(shè)計合成簡并引物，采用同源克隆的方法，從花鰻鱺腦垂體基因組DNA中擴增得到GH基因的中間片段；利用已克隆的中間片段，設(shè)計特異引物，獲得了 GH基因cDNA ;通過序列拼接，最終得到花鰻鱺生長激素編碼基因。I、總RNA提取提取花鰻鱺的腦垂體總RNA (提取方法參考Trizol Reagent RNA提取試劑盒的使用說明書)。2、反轉(zhuǎn)錄PCR :取上述提取得到的總RNA,使用購自TAKALA公司的Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒，參考說明書中的操作步驟，進行反轉(zhuǎn)錄PCR，獲得總cDNA (I)在超凈工作臺中，取DEPC處理的200μ I PCR管置冰上，依次加入總RNA2y I、引物(O. 5 μ g/ μ I) I μ g、無菌去RNA水10 μ I定容至總體積13 μ I (如表I),輕輕混勻；表I反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系I RNA2^ oligo (d'T) η primerI μ Watei'. nuclease-free10μ1 總體積 Μ(2) 65 °C 反應(yīng) 5min，重新置于冰上，依次加入 5XRT Buffer 4 μ I、RNaseinhibitor (20U/μ I) I μ I 和 IOmM dNTP Mix 2 μ I,混勻，用微量離心機 3000rpm 離心 30s。置PCR儀25°C 5min。取出置冰上冷卻。加入M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ I) I μ I至終體積21 μ I (如表 2)；表2反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系25 X Reaction Buffer4μ!RNase Inhibitor (20μ/μΠI μ IOmM dNTP Mix2μ1 M-MuLV Reverse Transcriptase (200 U /μΙ) Ιμ 總體積2hli(3)置 PCR 儀中按以下條件進行25°C /10min，42°C /60min，70°C /5min，立即冰上 冷卻，產(chǎn)物cDNA即用于PCR，保存于_30°C冰箱中。3、GH基因外顯子片段的獲取3. I引物的設(shè)計參考已報道的日本鰻鱺及歐洲鰻鱺的GH基因序列(登錄號分別為M24066. I和AY616666. I)，登錄Genebank下載其序列，分析保守區(qū)域發(fā)現(xiàn)外顯子部分高度保守，在外顯子序列兩端設(shè)計一對引物上游引物HMLF :5’ -ATGGCATCAGGGTTCCTTC-3’，下游引物HMLR :5’-CTACAGGGTGCAGTTGCTTTC_3’ ；3. 2PCR 反應(yīng)依次加入表3反應(yīng)物表3PCR反應(yīng)混合體系 cDNA μ Primer FΟ. μ Primer R0.1 μ1!丁叫°·1 .u^ dNTP Mix 4.7μ! QdH2O4μΙ總體積10μ1PCR 反應(yīng)程序94 °C 3min, (94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 72 °C 40sec) 33 個循環(huán)，72°C 8min, 4°C forever ；3. 3PCR產(chǎn)物檢測取3. 2PCR反應(yīng)的PCR擴增產(chǎn)物2份，每份5 μ I，于I. 0wt%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，Ig瓊脂糖加IOOml蒸餾水，微波爐煮沸熔化后，冷卻至60°C，加入溴化乙啶(EB，IOmg/ml)5l·! I ;電壓150V、時間為15min ;電泳結(jié)束后，用凝膠成像本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種花鰻鱺生長激素，其特征在于其氨基酸序列如SEQ？NO.1所示。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種花鰻鱺生長激素，其特征在于其氨基酸序列如SEQ NO. I所示。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花鰻鱺生長激素，其特征在于編碼所述的花鰻鱺生長...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉文生，張細權(quán)，李夢溪，聶慶華，尹立路，龐博，劉滿清，
申請(專利權(quán))人：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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