定點突變和定點修飾的生長激素、其制備方法及其應用技術

本發明專利技術涉及經過定點突變的生長激素、定點修飾的生長激素，所述生長激素可以是人源的，也可以是其它動物的。本發明專利技術還涉及定點突變和定點修飾生長激素的方法，所述方法包括使用基因密碼子擴展技術將非天然氨基酸定點引入生長激素基因中，借助非天然氨基酸與修飾劑，如聚乙二醇與生長激素定點連接。本發明專利技術進一步涉及定點突變或修飾的生長激素的應用，如作為穩定、長效生長激素等的用途。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物制藥領域，具體涉及定點突變和定點修飾的生長激素，所述的定點突變為用非天然氨基酸定點突變生長激素的天然氨基酸，還涉及將經過所述定點突變的生長激素進行定點修飾，例如進行聚乙二醇化的生長激素衍生物。本專利技術還涉及定點突變和定點修飾生長激素的方法，所述方法包括使用基因密碼子擴展技術將非天然氨基酸定點引入生長激素基因中，借助非天然氨基酸與修飾劑，如聚乙二醇與生長激素定點連接。本專利技術進一步涉及定點突變或修飾的生長激素的應用，如作為穩定、長效生長激素等的用途。
技術介紹
生長激素天然的人生長激素(hGH)(Bazan, F. Immunology Todyll: 350-354 (1991) ;Mott, H. R.和Campebel1，I. D. Current Opinion in Structural biology5:114-121(1995);Silvennoinen, 0.和 Ihle, J. N. (1996)SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS)是由人下腦垂體分泌的蛋白質，生長激素的分子量為22kD，其由191個氨基酸殘基組成，序列如下FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFS ESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLL KDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKV ETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:I)編碼hGH的堿基序列如下TTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCG TCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGG AACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATT CCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTCCGCAT CTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCG CCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTA GAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCA GATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTAC TCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTC CTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAA (SEQ ID NO 2)hGH的主要生物學功能是促進幼小的哺乳動物身體組織的生長并保持住老年哺乳動物的組織，其中所涉及的組織包括骨骼、結締組織、肌肉、以及諸如肝、腸、和腎等器官的組織。因此hGH可用于治療因腦垂體機能不足而導致的侏儒癥或Turner綜合征，另外也可用于促進兒童生長，治療慢性腎功能不全、艾滋病衰竭和衰老等。由于人生長激素是蛋白質，其體內半衰期小于2小時，因此用藥手段主要局限于頻繁的注射方法，常規的方法為每天注射，用藥周期在六個月到一年，這種頻繁的注射，給病人帶來嚴重的不便，并且提高了用藥成本(Clar R,等，1996，J BiolChem271:21969-21977 ；hoffman AR,等，2005, J Clin Endocrinol Metab90:6431-6440)。因此，改善生長激素的用藥方法，減少用藥頻率，降低用藥成本，提高病人依從性，增加療效成為重要課題。聚乙二醇修飾共價連接親水性聚合物聚乙二醇(PEG)是一種增加生物活性分子(包括蛋白、肽尤其是疏水性分子)的水溶性、提高其生物利用度、延長血清半衰期、調節免疫原性、提高生物活性常用的方法。PEG已經廣泛用于藥品修飾、人工移植等方面，提高了藥品的生物相容性、降低其毒性和免疫原性。為使得PEG的特性最大化，與生物活性分子連接的PEG聚合物的總分子量和水合狀態必須足夠高以賦予通常與PEG聚合物連接有關的有利特征，例如增加其水溶性和循環半衰期，而不會影響母體分子的生物活性(MacGillivray等人，J. Clin.Endocrinol. Metab. 1996, 81:1806-1809)。利用聚乙二醇(PEG)修飾蛋白質，可以延長其半衰期，減少免疫原性，增加穩定性，是一項已成功得到應用的技術。目前利用此技術開發的產品，已經上市的包括PEG-門 冬酰胺酶，PEG-ADA (腺苷脫氨酶)，PEG-干擾素和PEG-GCSF (粒細胞集落刺激因子)。其中PEG-干擾素由原來的每兩天或每天注射一次降低到每周一次，而且療效顯著改善。PEG-GCSF也有每天注射一次改善為給個化療療程注射一次(Bailonetal. , BioconjugateChem.，12:195-202，2001;Kinstler et al.，US Patent5985265，1999;Kinstler etal.，Pharm. Res.，13:996-1002，1995)。現有蛋白聚乙二醇化學修飾過程中會有一些副反應的發生。例如，組氨酸含有反應活性的亞氨基(-N (H)-)，但許多與-NH2反應的化合物也可與(-N (H)-)-反應。同樣，氨基半胱氨酸的側鏈具有游離巰基，其結構式為-SH。在有些情況下，PEG與賴氨酸-NH2反應的同時，也能與半胱氨酸、組氨酸或其他殘基反應。如此產生經PEG修飾后的復雜混合物，并且有可能破壞所修飾蛋白的生物活性。因此，需要在蛋白內單一位點處引入化學官能基團，使得一種或一種以上的PEG聚合物能夠在蛋白表面上處選擇性偶合到蛋白上(Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylationj Nektar MolecularEngineering Catalog，2003， 1-17)。遺傳密碼擴展技術經過數年的研究，人們對原核生物核糖體的翻譯機制已有較全面的理解，多種核糖體不同功能狀態的晶體和電鏡結構已得到解析，大多數氨酰t RNA合成酶的結構也已獲得。基于這些研究成果，近年來發展起來了遺傳密碼擴展的技術一利用琥珀終止密碼子(TAG)來編碼多種非天然氨基酸并在生物活體內將其定點插入。到目前為止，這一技術已經將幾十種非天然氨基酸成功地定點表達在活細胞的蛋白質當中，賦予了這些蛋白質新穎的物理、化學和生理性質。使用這一方法，可以將非天然氨基酸(包括親和標記和光致異構化的氨基酸、羰基氨基酸和糖基化氨基酸)引入蛋白質中(L. Wang等人，(2001)，SCIENCE292本文檔來自技高網...

【技術保護點】
定點突變的生長激素，其在特定位點的1個氨基酸被突變為非天然氨基酸，所述非天然氨基酸選自：所示的Lys？diazirine，所示的Lys？azido，或其它含有雙吖丙啶、疊氮結構的非天然氨基酸中的至少1種；所述特定位點選自：示于SEQ？ID？NO：1的序列的第Y35位,P48位,Q49位，S57位，K70位，L87位，G131位，R134位，Y143位和K145中的1個位點。FDA00001805184100011.jpg,FDA00001805184100012.jpg

【技術特征摘要】
2011.06.23 CN 201110171781.71.定點突變的生長激素，其在特定位點的I個氨基酸被突變為非天然氨基酸，所述非天然氨基酸選自2.定點突變的生長激素，其與示于SEQID NO :1的序列的區別在于在SEQ ID NO 1所示的序列的第N位的氨基酸被突變為Lys-diazirine，所述突變氨基酸與SEQ ID N0:1所示的序列的連接方式如下式所示3.定點突變的生長激素，其與示于SEQID NO :1的序列的區別在于在SEQ ID NO 1所示的序列的第N位的氨基酸被突變為Lys-azido，所述突變氨基酸與SEQ ID N0:1所示的序列的連接方式如下式所示4.經過修飾的權利要求I一 3中任一項的定點突變的生長激素，其連接方式如下式所示，其中R5和R6獨立地為H、相同或不同分子量PEG，環糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修飾基團，且二者不同時為H，5.權利要求4的經修飾的定點突變的生長激素，所述修飾為在R7上連接不同分子量PEG,環糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修飾基團。6.編碼突變的生長激素的核酸分子，所述核酸分子與編碼SEQID NO :1的核酸分子SEQ ID NO :2的區別在于，其中編碼SEQ ID N O :I的第Y35位，P48位，Q49位，S57位，K70位，L87位，G131位，R134位，Y143位，K145位的氨基酸中的一個氨基酸的密碼子被突變為TAG。7.核酸載體，其可操作地連接有權利要求5的核酸分子。8.宿主細胞,其中含有權利要求6的核酸載體。9.權利要求7的宿主細胞，其中還含有表達甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(tRNApyl)的質粒。10.權利要求7或8的宿主細胞，其為真核宿主細胞或原核宿主細胞。11.定點改良生長激素的方法，包括步驟 (1)選擇步驟在生長激素的氨基酸序列中選擇期望突變的一個或多個特定氨基酸位占. (2)基因突變將編碼對應于(I)中選擇的位點的生長激素的氨基酸的密碼子用基因工程方法突變為密碼子TAG ； (3)表達載體構建將(2)基因突變步驟得到的突變的生長激素的編碼序列與合適的載體可操作地連接，得到突變序列表達載體； (4)獲得pACYC-tRNA/PylRS質粒從保藏日為2011年6月14日、保藏號為CGMCCNo 4951的大腸埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中獲取質粒pACYC-tRNA/Pyl...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周德敏，張傳領，肖蘇龍，張雨帆，俞飛，趙傳科，陳景賢，張禮和，
申請(專利權)人：北京大學，
類型：發明
國別省市：