一種檢測豬尿中鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑板制造技術

本實用新型專利技術涉及一種檢測豬尿中鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑板，可用于檢測豬尿中是否含有鹽酸克倫特羅殘留。本實用新型專利技術試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，可將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。該試劑板可進行半定量直觀檢測，整個操作過程僅需5分鐘左右，且無需任何昂貴實驗設備輔助，利于大規模樣本篩選，適合屠宰企業及政府檢測機構檢測需求。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本技術涉及一種檢測鹽酸克倫特羅的試劑板，具體涉及一種檢測豬尿中鹽酸克倫特羅殘留的免疫膠體金試劑板。
技術介紹
鹽酸克倫特羅(clenbuterol，CLEN)是一種β -興奮劑類藥物，在臨床上通常用來防治哮喘、肺氣腫等肺部疾病。當其應用劑量達到治療量的5-10倍時，又具有能量重新分配、改變養分代謝途徑的作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉積減少，明顯促進動物生長，因此，常被用做飼料添加劑。由于用量大、使用的時間長、代謝慢，所以在動物體內的殘留量很大。人類食用了殘留有鹽酸克倫特羅的食品動物后，會出現不同程度的中毒現象。常見有惡心、頭暈、四肢無力、手顫等中毒癥狀，特別是對心臟病、高血壓患者危害更大。長期食用則有可能導致染色體畸變，誘發惡性腫瘤，重者甚至會導致死亡。為保障畜牧業的持續健康發展和人民的身體健康，我國農業部已在176號公告《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》中將鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、西馬特羅、特布他林列入了禁用清單。2002年農業部發布第193號公告，明確將克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅及其鹽、酯及制劑列入食品動物禁用獸藥。同年農業部又發布第235號公告，在所有食品動物的所有可食組織中不得檢出克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅及其鹽、酯。而歐盟在1988年就立法禁止使用鹽酸克倫特羅。盡管我國明令禁止使用，然而，受經濟利益驅動以及缺乏有效的監測手段，目前仍有不少養殖戶違令使用興奮劑，因此，建立科學、規范的藥物殘留監控方法十分必要。目前豬尿中有關鹽酸克倫特羅的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS-MS)、酶聯免疫吸附法(ELISA)以及近幾年發展起來的膠體金免疫層析法(GICA)等。高效液相色譜法是目前國內測定β_興奮劑類藥物使用最多、也是比較權威的方法，靈敏度高、重復性強、能同時分析多種β_興奮劑類藥物。關于β_興奮劑類藥物的液相色譜分析法已有多項國家標準及行業標準發布實施，該法檢出限可達O. 3 I μ g/kg(ppb)。但該法的樣品前處理相對繁瑣，檢測周期長、程序復雜、所需試劑繁多、操作時需要專門的技術人員，難以滿足現代檢測快速、簡捷、現場化的要求，不適于大規模樣本篩查。免疫分析法是將抗原抗體反應與靈敏的檢測系統結合而成的一種簡便、快速、敏感的分析方法，一般不需要昂貴的儀器、前處理簡化、靈敏、特異性強、快速，越來越多地被用于食品中藥物等殘留的檢測。目前，應用廣泛的免疫分析方法主要是酶聯免疫吸附法和膠體金免疫層析法。酶聯免疫吸附法是應用抗原抗體特異性反應和酶的高效催化作用來測定β -興奮劑類藥物含量的免疫分析方法，具有特異性強、靈敏度高、快速、簡便等優點。但是ELISA法中酶的活性易受反應條件影響，由此易造成測定結果重復性較差。而且需要用到昂貴的特殊儀器設備，具有一定的局限性。膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術的基礎上建立的一種簡易快速的免疫學檢測技術。該方法將反應所需要原料的全部或大部分整合到試劑中，可在5-10min內完成對樣品中β_興奮劑類藥物的定性和半定量測定，具有簡單、快速、靈敏度高等特點，無須儀器設備配合測定，檢測既可在實驗室中進行，也可在養殖場等進行實地測定。
技術實現思路
本技術針對檢測需求，研制開發一種檢測豬尿中鹽酸克倫特羅殘留的免疫膠體金快速檢測試劑板。本技術試劑板操作簡便快捷，靈敏度高，特異性好，實驗結果肉眼可直觀判斷，無需配備儀器設備，5-10min即可完成對樣品中鹽酸克倫特羅藥物殘留的測定。 本技術試劑板應用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標抗體反應顯色，特異性檢測豬尿中的鹽酸克倫特羅藥物殘留水平。如果樣品溶液中含有鹽酸克倫特羅殘留，鹽酸克倫特羅先和膠體金顆粒上的抗體反應，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的鹽酸克倫特羅藥物占據而無法與檢測線上鹽酸克倫特羅特異性抗原結合；當樣品中的鹽酸克倫特羅含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線無顯色，判定為陽性。反之，當樣品中鹽酸克倫特羅含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色，判定為陰性。本技術試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有1_2_的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進行。膠體金結合墊上包被有抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體與膠體金的結合物；硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和控制線。偶聯鹽酸克倫特羅的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血藍蛋白(KLH)等。本技術試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標示各功能區(加樣孔、檢測區、控制區)的作用。背襯，由一面涂有不干膠的聚氯乙烯(PVC)材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液pH值的作用。膠體金結合墊，由聚酯膜制成，其上有抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體與膠體金顆粒的結合物，為樣品溶液中有效成分和金標抗體反應提供場所。硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊，由濾紙制成，吸收反應過程中多余的溶液。本技術試劑板具有如下有益效果(I)特異性好。本技術試劑板對鹽酸克倫特羅的交叉反應率為100%，對如沙丁胺醇、萊克多巴胺等β-興奮劑類藥物的交叉反應率均低于I%。可見，本技術試劑板對鹽酸克倫特羅反應具有高度專一性。(2)靈敏度高。本技術試劑板對豬尿樣品中鹽酸克倫特羅的檢出限為3. Oppb,適用于各類企業及檢測機構。(3)操作簡單快捷。本技術試劑板將反應所需的大部分原料整合到PVC背襯中，滴樣后抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮短了檢樣時間，滴樣后3-5分鐘即可讀取結果。本試劑板的使用不需任何專業培訓，普通人員均可操作。(4)不依賴于實驗設備。本技術試劑板在直接滴樣跑板后，通過肉眼判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和控制線的顏色深淺來判讀結果，整個檢測實施過程不依賴任何實驗設備，尤其適合于野外及現場操作，易于推廣。(5)成本低，易推廣。本技術試劑板生產工藝簡單，可實現單個樣本檢測，生產 成本低，大大降低了檢測費用。附圖說明圖I為鹽酸克倫特羅免疫膠體金試劑板背襯結構示意圖，其中I為樣品墊，2為膠體金結合墊，3為硝酸纖維素膜,4為檢測線,5為控制線,6為吸水墊,7為不干膠,8為PVC背襯。圖2為鹽酸克倫特羅免疫膠體金試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制區，T為檢測區。圖3為鹽酸克倫特羅免疫膠體金試劑板結果判定示意圖，其中C為控制區，T為檢測區。具體實施方式本技術試劑板的制備包括載體蛋白偶聯物的制備，抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標記抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備和鹽酸克倫特羅免疫膠體金試劑板的組裝。I.半抗原與載體蛋白的偶聯稱取20mg鹽酸克倫特羅，用2mL O. 5mol/L的硫酸溶液溶解，混勻后加入300 μ L10mg/mL的亞硝酸鈉,持續反應2h。在攪拌下,將溶液逐滴加入到本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測豬尿中鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑板，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，相鄰各部分間有1？2mm的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進行。

【技術特征摘要】
1.一種檢測豬尿中鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑板，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，相鄰各部分間有1_2_的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進行。2.如權利要求I所述的試劑板，其特征在于試劑板的硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張少恩，桑麗雅，
申請(專利權)人：杭州南開日新生物技術有限公司，
類型：實用新型
國別省市：