本發明專利技術涉及一種無糖基化的重組人血清白蛋白-粒細胞集落刺激因子突變體，通過對重組人血清白蛋白粒細胞集落刺激因子基因的潛在糖基化位點進行突變，剔除了重組人血清白蛋白-粒細胞集落刺激因子的潛在糖基化位點，然后轉化到畢赤酵母或者釀酒酵母中，發酵純化，最后得到無糖基化的重組人血清白蛋白-粒細胞集落刺激因子突變體，該突變體克服了原先重組人血清白蛋白-粒細胞集落刺激因子融合蛋白由于糖基化修飾帶來的影響藥代動力學和免疫反應問題，更適合于用于人體臨床研究或治療應用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種無糖基化的重組人血清白蛋白粒細胞集落刺激因子突變體融合蛋白的構建及其制備方法。
技術介紹
大多數的蛋白藥物只能采用皮下注射或靜脈注射等方式給藥，這類蛋白藥物因蛋白酶的作用和腎小球的濾過，在人體內的半衰期比較短，體內清除率高，往往只有幾分鐘至幾小時的半衰期，造成給藥頻繁，給患者造成諸多困難和不便。此外，其穩定性等也是影響其在體內發揮其功效的因素。因此，如何消除或降低此類蛋白類藥物的抗原性、延長其體內半衰期及增加穩定性是生物制藥領域的一個熱門課題。天然的人粒細胞集落因子(hG-CSF)具有174個氨基酸，若是通過大腸桿菌表達 的重組人粒細胞集落因子(rhG-CSF)因為需要在N-端添加甲硫氨酸而具有175個氨基酸。已上市的重組人粒細胞集落因子注射液藥物多為經大腸桿菌表達的175位氨基酸的rhG-CSF,其在腫瘤放療、化療引起的粒細胞減少癥、再生障礙性貧血、放射病等血液病的治療及骨髓移植方面具有重要作用，現已應用于臨床，是每年銷售額最大的幾個生物制品藥物之一。但是hG-CSF血漿中衰期短，為了達到體內效果一個周期內需要多次給藥，這既增加了病人的痛苦，又增加醫療費用，還會引起一些副反應并增加了感染的風險。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是人體血清中的主要成分,對維持體內滲透壓和血漿體積起著至關重要的作用。人血清白蛋白具有585個氨基酸，是分子量為65kD的非糖基化蛋白，腎清除率非常低，體內半衰期為14 20d。它也是體內因子和藥物轉運的天然載體。研究表明將治療性蛋白基因與人血清白蛋白基因融合所表達的融合蛋白可明顯降低體內藥物的清除速率，延長生物半衰期。Yeh等發現，克魯維氏酵母表達的HSA-CD4融合蛋白在以家兔為動物模型的實驗中半衰期比單獨的CD4延長了 140倍。而克魯維氏酵母表達的HSA-IFNa的融合蛋白(albuferon)在稱猴體內的半衰期比單獨的IFNa 延長了大約 18 倍(Blaire L.等,TheJournal of Pharmacology And ExperimentalTherapeutics. 2002,303 :540-548)。人血清白蛋白是血液循環中的一個非常重要的天然蛋白，在體液循環中可存在20天以上。研究表明將人粒細胞集落因子與人血清白蛋白基因融合所表達的融合蛋白可明顯降低體內藥物的清除速率，延長生物半衰期。與人血清白蛋白融合表達的人粒細胞集落因子，即rHSA-hG-CSF有比普通hG-CSF更長的半衰期，從而可以大大減少hG-CSF治療的給藥次數。已有相當多的文獻報導了 rHSA-hG-CSF融合蛋白的構建，例如中國專利申請 01124114. 4,02142881. 6,200710020034. 7 和 200810024988. X，美國專利 5876969，wo01/79480,以及非專利文獻(W endy Halpern r等，AlbugraninTM,a Recombinant HumanGranulocyte Colony Stimulating Factor(G-CSF)Genetically Fused to RecombinantHuman Albumin Induces ProlongedMyelopoietic, Pharmaceutical Research, Vol.19,No. 11, November2002)。上述文獻報道的rHSA-hG-CSF通常利用酵母系統表達，例如畢氏酵母。畢赤酵母是作為外源基因表達系統，具有許多明顯優點，其誘導分泌表達的啟動子AOXl可用甲醇嚴格調控，表達產物分泌到上清，不需復雜的破菌手段。而且表達上清的雜蛋白含量很低，有利于進一步的分離純化。但是畢赤酵母系統會對目標蛋進行糖基化修飾，這種糖基化修飾同哺乳動物的糖基化存在著一些差異，例如畢赤酵母高甘露糖型修飾可能導致藥物蛋白代謝動力學性質不良和產生免疫反應，這是限制該類蛋白作為治療性藥物的一個因素。因此，對現有rHSA-hG-CSF融合蛋白進行改造和突變，獲得無糖基化位點的rmHSA-hG-CSF,就具有重大的意義。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種無糖基化的重組人血清白蛋白粒細胞集落刺激因子突變體。通過蛋白質糖基化位點預測模擬網站(http://www. cbs. dtu. dk/services/NetOGlyc/)，本申請專利技術人發現，人血清白蛋白(HSA)蛋白序列中上沒有糖基化位點，但是 在人粒細胞刺激因子上有一個0-糖基化位點，這個0糖基化位點是位于G-CSF第133位的蘇氨酸(Thr)。針對該發現，專利技術人通過大量實驗對G-CSF第133位的蘇氨酸進行點突變，以期能消除蛋白糖基化問題。最后意外發現，把人粒細胞集落刺激因子上的Thr-133突變成Gly、Ala和Met，經過鑒定，最后得到無糖基化的重組人血清白蛋白粒細胞集落刺激因子突變體(rmHSA-GCSF)，且突變蛋白的生物學活性基本不變。因此，本專利技術首先提供了一種重組人血清白蛋白粒細胞集落刺激因子突變體(rmHSA-GCSF)，所述突變體中的人血清白蛋白的C末端可以直接或通過一柔性的連接肽序列與人粒細胞集落刺激因子的N端相連，或者人粒細胞集落刺激因子的C末端直接或通過一柔性的連接肽序列與人血清白蛋白的N端相連，所述人粒細胞集落刺激因子上第133位的Thr突變成Gly、Ala或Met。上述的重組人血清白蛋白粒細胞集落刺激因子突變體(rmHSA-GCSF)中，所述的人粒細胞集落刺激因子可以是天然G-CSF或天然G-CSF的功能類似物，所述的功能類似物為經過個別氨基酸殘基的取代、缺失或增加得到的G-CSF多肽，生物學活性與天然G-CSF基本相同。優選的功能類似物是在天然G-CSF的N端添加甲硫氨酸(Met)，相應的將第134位的Thr突變成Gly、Ala或Met。上述的重組人血清白蛋白-粒細胞集落刺激因子突變體(rmHSA-GCSF)中，柔性連接肽序列通式為 n，n為1_10的整數，優選的是n為1_3的整數，最優選n為I。優選的，上述的重組人血清白蛋白粒細胞集落刺激因子突變體(rmHSA-GCSF)的蛋白序列分別如Seq ID No. I-Seq ID No. 12所示。本專利技術的另一目的是提供編碼重組人血清白蛋白粒細胞集落刺激因子突變體(rmHSA-GCSF)的DNA序列，優選的是編碼分別如Seq ID No. I-SeqID No. 12所示蛋白序列的DNA序列。通過常規分子生物學實驗技術，可將上述的DNA序列連接到合適的表達載體上，得到攜帶編碼本專利技術融合蛋白的DNA序列的重組表達載體。本專利技術的重組表達載體包括pPIC3、pPIC9、pHIL-Dl、pA0804、pA0815、pPSC3K 質粒等。本專利技術的再一個目的是提供表達本專利技術融合蛋白編碼基因的宿主。本專利技術的宿主可以是被重組表達載體或重組表達載體的一部分轉化，含有本專利技術融合蛋白編碼基因的細菌、酵母、動物細胞或植物細胞；其中優選的是酵母，更優選的是畢赤酵母，最優選的是畢赤酵母GS115。融合蛋白可以存在于宿主細胞內，也可以是從宿主中分泌出來，優選的，是從宿主本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種重組人血清白蛋白粒細胞集落刺激因子突變體(rmHSA？GCSF)，所述突變體中的人血清白蛋白的C末端可以直接或通過一柔性的連接肽序列與人粒細胞集落刺激因子的N端相連，或者人粒細胞集落刺激因子的C末端直接或通過一柔性的連接肽序列與人血清白蛋白的N端相連，所述人粒細胞集落刺激因子上第133位的Thr突變成Gly、Ala或Met。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：單劍峰，王昌梅，金榮，嚴春霞，張昕，戎亞雯，李亞飛，游修鼎，
申請(專利權)人：杭州九源基因工程有限公司，
類型：發明
國別省市：
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