一株可以定植于腸道中的益生菌，其特征在于所述益生菌（Lactobacillusplantarum?P8）分離自由中國境內采集的酸馬奶樣本，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號：CGMCC?No.5468，保藏日期為：2011年11月18日。益生菌Lactobacillus?plantarum?P8在腸道中的檢測方法，其特征是包括下列步驟：（1）糞便樣品中宏基因組DNA的提取；（2）L.plantarumP8的特異性片段的擴增；（3）瓊脂糖凝膠電泳；（4）RT-PCR檢測樣品中L.plantarum?P8的數量；（5）腸道中益生菌L.plantarum?P8定植能力的檢測。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及，應用該方法對益生菌進行檢測，可準確、快速的完成腸道中益生菌的定性和定量研究。
技術介紹
人類的腸道棲居著龐雜多樣的微生物群落。這些微生物聚集在人類腸道內，其數量超過腸道的細胞，因此在人體腸道是一個多樣性豐富動態平衡的生態系統。這個系統像是一個棲息地，一些微生物成員可以在此根深地固，一些卻像是搭便車轉瞬即逝。目前腸道菌群之間，及其與宿主的關系越來越引起人們的重視并成為研究熱點。對其關系最常見的描述為共生(一個伙伴受益而其他的不受影響)而不是互惠(包括合作伙伴都一起受益)，這對穩定這個可持續發展的腸道環境是十分關鍵的。研究發現，不同腸道微生物結構和組 成影響著宿主的營養物質加工、能量平衡、免疫功能、胃腸道發育及其他多種重要的生理活動，進而直接影響人類健康。在現代分子生物學技術的幫助下，腸道微生物的研究也深入到了基因和作用機制水平。人體腸道菌群可分為硬壁菌門，擬桿菌門，放線菌門，梭桿菌門，變形菌門，疣微菌門，藍藻菌門。這些菌門的劃分都基于對最全面和多樣性16SrRNA測序的研究。在所有細菌的染色體基因組中，16S rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的rDNA序列，并具有高度的保守性和特異性。因此在生物進化的過程中16S rRNA變化級小，所以可以根據測定其序列追根溯源不同生物的親緣關系。益生菌(Probiotic)，源于希臘語“對生命有益”，是定植于人體腸道內，能產生確切健康功效的活的有益微生物的總稱，早在上個世紀初(190 7年)著名細菌學家諾貝爾獎得主梅切尼科夫即提出益生菌可以延年益壽的假說。益生菌主要包括乳桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium),其益生作用主要是通過直接或者間接的調整宿主腸道微生物的組成，激活宿主內源性微生物群或者免疫系統的活性來實現的。口服益生菌能夠治愈或緩解多種胃腸道或與胃腸道相關的疾病，目前研究證實口服益生菌有助于緩解乳糖不耐癥，預防或者治愈胃腸炎(gastroenteritis)、抗生素相關性腹灣(antibiotic-associateddiarrhea)、旅行性腹灣(traveler，sdiarrhea)、便秘(constipation)及腸道感染(intestinal infections),同時可抑制有害微生物在宿主腸道中定植，對腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)、炎癥性腸炎(inflammatorybowel disease, IBD)及結腸癌(colon cancer)等腸道相關性疾病具有良好的預防和治療作用。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供，以L. plantarum P8的全基因組序列中一段特異性片段為依據，設計了該菌株的特異性引物，使用該引物對目的菌株擴增和RT-PCR定量，可以快速準確的完成人體腸道中L. plantarumP8的定性定量研究。本專利技術的技術方案是一株可以定植于腸道中的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus plantarum P8)分離自由中國境內采集的酸馬奶樣本,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名植物乳桿菌，保藏號=CGMCC No. 5468，保藏日期為2011年11月18日。益生菌在腸道中的檢測方法，其特征是包括下列步驟I、糞便樣品中宏基因組DNA的提取采用液氮凍融一CTAB法取I. Og糞便樣品洗滌處理，將洗脫的菌體于I. 5mL離心管中，立即置于液氮中完全凍結，取出后放入65°C水浴中融化(約5min)，反復凍融3次，力口0. ImL 10%SDS和10. 0 ii L 10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒溫搖床中200r/min搖動2h，室溫下12000g離心lOmin，收集上清液轉移至另一離心管中。上清液與等體積的氯仿于12000g離心IOmin (為了使沉淀、水相和有機相分層)，吸取上清液轉移至另一離心管中進行酚氯仿抽·提2次，經0. I倍體積的醋酸鈉，I倍體積的冰異丙醇沉淀總DNA，然后70%乙醇洗滌沉淀2次，回溶備用。2. L. plantarum P8的特異性片段的擴增擴增引物以L. plantarum P8的全基因組序列為依據,采用本實驗室自主設計的引物前序列，該引物序列及擴增片段的具體信息為ATCGGTTA kCTMCGGGAGGAGTCAl GGGCGTGCGCCGAGCGGAAATTATCAATGGCTTACGATGGTCAGTAGTAGCGGACGCATTAGGGTTGCCCGCGGAAAATCGTCAACGGGGAACTTATCCGTTAATTACGGAAATGGTCGCAAGTGACTTTTGGAAACAGCCAGCAGGGAGCTGGTCTGATGACACATCGATGAGTTTAGGATTGATTGAGAATTTGGTTAGCGGTGGTGATTATGATGATCTCAT jfcCCGMffllillgfCTATGCGCTTTGGAACGAACACGC擴增體系反應體系50ii L :10XPCR Buffer 5u L,25mmol/L Mg2+L 0 y L，2. 5mmol/LdNTPs4 u L, 5mmol/L 上下游引物各 2 y L, DNA 模板 IOOng 左右，5U/ u LTaq SI (Promega) 0. 5uL, ddH2O補足至50ii L。擴增條件95°C 變性 5min ;循環 30 次95°C 變性 lmin，62 °C 退火 45s，72 °C 延伸 lmin，然后72°C 延伸 7min，4°C 保存。3.瓊脂糖凝膠電泳將PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓，電泳20_30min，EB染色，紫外拍照，檢測擴增效果。4. RT-PCR 檢測樣品中 L. plantarum P8 的數量首先應用已知數量的L. casei Zhang通過RT-PCR擴增制作標準曲線，然后以標準曲線為依據，用上述特異性引物定量檢測樣品中L. caseiZhang的數量。RT-PCR 擴增體系反應體系20 ii L :10 XPCR mix 10 y L，10mmol/L 上下游引物各 0. 4 y L，DNA 模板IOOng 左右，dd H2O 補足至 20 u L。RT-PCR 擴增條件95°C變性 20s ;循環 40 次95°C變性 5s，62°C退火 30s，72°C延伸 45s。5.腸道中益生菌L. plantarum P8定植能力的檢測隨機選取33名近三個月內無抗生素類藥物攝入的志愿者(性別比例17 :16)，每日 服用含益生菌Lactobacillus plantarum P8的片劑(活菌數>2xl0lcl個/粒)3粒,連續服用28天，分別于0天，14天，28天以及停止服用菌片后一周(35天)，兩周(42天)和四周(56天)采集志愿者糞便樣品。樣品采集后迅速放入液氮中速凍，并在8小時內完成糞便樣品宏基因組DNA的提取。而后應用Lactobacillus plantarumP8的特異性引物進行RT-PCR擴增，檢測不同時間內各志愿者體內Lact本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株可以定植于腸道中的益生菌，其特征在于所述益生菌（Lactobacillusplantarum？P8）分離自由中國境內采集的酸馬奶樣本，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號：CGMCC？No.5468，保藏日期為：2011年11月18日。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張佳超，王麗鳳，高鵬飛，
申請(專利權)人：北京和美科盛生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。