本發明專利技術公開了一種檢測血漿中亞甲藍含量的方法，包括如下步驟：(a)向空白血漿中加入羧甲基-β-環糊精飽和溶液，使其濃度為1～4.5mmol/L，定容，得血漿空白樣本；(b)向空白血漿中加入定量的亞甲藍溶液，并加入羧甲基-β-環糊精飽和溶液，得含亞甲藍濃度為Cs的血漿標準樣本；(c)向含亞甲藍的待測血漿樣本中加入羧甲基-β-環糊精飽和溶液，得含亞甲藍濃度為Cx的血漿待測樣本，檢測上述樣本的熒光峰強度或熒光峰面積；然后按對照品比較法計算即可得到待測血漿樣本中的亞甲藍濃度Cx。本發明專利技術的最低檢測限已經低至0.012μmol/L，取得了意想不到的效果。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及，屬于臨床檢驗、藥物分析、生物分析和分析化學領域。
技術介紹
為了降低臨床上輸血感染病毒的危險，增強輸血的安全性，一般采用亞甲藍滅活血漿中的病毒，即光化學病毒滅活法，即通過在血漿中加入一定量的光敏劑亞甲藍，在光照下產生光化學反應，從而使血漿中病毒失活。為了保證血漿的安全性，在滅活前必須保證血漿中有足夠濃度的光敏劑亞甲藍(即足夠高的釋放量)，在滅活后的成品血漿中又必然保證 有足夠低濃度的光敏劑亞甲藍(即足夠低的殘留量)，從上述血漿處置工藝分析，這顯然是互相矛盾的。為了較好地解決這對矛盾，通常使用成套病毒滅活袋，它由亞甲藍貯藏裝置、光照病毒滅活袋、亞甲藍過濾裝置、成品血漿貯藏袋及其相應的管線和開關組成。在血漿注入并通過亞甲藍貯藏裝置時，其中的亞甲藍被釋放出來，隨血漿進入光照病毒滅活袋，在病毒滅活之后，通過亞甲藍過濾裝置濾除大多數的亞甲藍，從而獲得臨床用成品血漿。經過過濾裝置濾除的血漿，其殘留的亞甲藍的濃度雖然在安全范圍內，但對于必須大量或長期輸注血漿或輸血漿后預期將長期存活的患者，其影響仍不得而知，特別是致突變的風險有可能增加，所以控制血漿中殘留亞甲藍濃度有重要意義。目前，檢測血漿中亞甲藍含量的測定方法有分光光度法、化學發光法、高效液相色譜法及以金納米微粒為探針的共振瑞利散射法等，這些方法有靈敏度低和/或操作繁瑣等缺點，常常還需要消耗較大量的血漿。2012年版《中國輸血技術操作規程》中報道了血漿中亞甲藍殘留量檢測方法，采用了固相萃取小柱對血漿樣品和標準品中的亞甲藍進行萃取分離，結合分光光度法測定其殘留量。然而，在實際應用中發現該方法存在兩個顯著的缺點(1)操作特別煩瑣、費時，血漿消耗量大；(2)樣本測定吸光度值特別低，通常小于0.01 ;這與《中華人民共和國藥典》“附錄IV A紫外-可見分光光度法”項下所規定的準確測定含量所需要的吸光度0.3、. 7比較，所測定殘留量顯然是不準確的。而事實上，在低殘留量時，吸光度的重現性特別差，預示著測定結果的不可靠。這一點與文獻報道也是一致的。對于通常的亞甲藍殘留量為0.13umol/L(微摩爾/升)時，楊夏等[病毒滅活血漿亞甲藍含量的檢測及質量控制，中國輸血雜志，2011，24 =881-883]的方法測定，其吸光度應為0. 0076，白莉等[固相萃取法檢測病毒滅活血漿中的亞甲藍，醫藥論壇雜志，2010，31 =108-109]的方法測定，其吸光度應為0.0042，張淑琴等[血漿中亞甲藍含量的檢測，臨床輸血與檢驗，2010，12 36-38]的方法測定，其吸光度應為0. 0011。由上可見，對于實際樣本，這些吸光度值均是如此之低，顯然，固相萃取一紫外可見分光光度法測定結果的可靠性極低。針對上述問題，周群剛等[文獻I : P -環糊精增敏熒光分光光度法檢測血漿亞甲藍，臨床檢驗雜志，2011，29 (5) =344-345]公開了一種P _環糊精增敏熒光分光光度法測定血漿中光敏劑亞甲藍，相對于上述方法，該方法明顯克服了上述兩個缺點。但是，該方法能準確檢測的最低定量限為0. 089 iimol/L，即略低于通常的亞甲藍殘留量(目前，對于通常使用的 成套病毒滅活袋，其亞甲藍殘留通常在0. 13umol/L左右)。事實上，實際血漿樣本中最低殘留量往往會低于0. 089 u mol/L,如文獻2 [亞甲藍/光化學法在血漿病毒滅活中應用，中國公共衛生，2008,24(11)，1365]中提到該研究中亞甲藍的最終殘留量為0.071.621! mol/L (文章第四段)。況且，從長遠分析，隨著技術的發展和人們對血漿要求的提高，亞甲藍殘留量將會越來越低。這顯然會導致文獻I中的方法失效，無法用于血漿亞甲藍殘留的常規檢控。因此，開發，以進一步降低檢測限，并提高檢測靈敏度，具有積極的現實意義。
技術實現思路
本專利技術目的是提供，以進一步降低檢測限，并提聞檢測靈敏度。為達到上述目的，本專利技術采用的技術方案是，包括如下步驟 (a)向空白血漿中加入羧甲基-￠-環糊精飽和溶液，使其濃度為f4.5mmol/L，定容，得血漿空白樣本，采用熒光分光光度計進行檢測，測得熒光峰強度或熒光峰面積為Fo ； (b)向空白血漿中加入定量的亞甲藍溶液，并加入羧甲基-￠-環糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍濃度為Cs的血漿標準樣本，采用熒光分光光度計進行檢測，測得熒光峰強度或熒光峰面積為Fs ； (C)向含亞甲藍的待測血漿樣本中加入羧甲基-￠-環糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍濃度為Cx的血漿待測樣本，采用熒光分光光度計進行檢測，測得熒光峰強度或熒光峰面積為Fx ； 然后按對照品比較法計算即可得到待測血漿樣本中的亞甲藍濃度Cx ； 所述步驟(a)、(b)和(C)中采用的熒光分光光度計進行檢測的條件相同，激發波長為665±8nm，發射波長掃描范圍為67(T715nm，激發狹縫寬度2 10nm，發射狹縫寬度2 10nm，掃描速度100 1000nm/min,激發光程2 IOmm,發射光程2 10mm。上文中，所述向空白血漿中加入羧甲基-￠-環糊精飽和溶液，使其濃度為1^4. 5mmol/L,這里的濃度是指加入羧甲基-P -環糊精飽和溶液之后的血漿中的羧甲基-￠-環糊精的摩爾濃度。上述技術方案中，所述步驟(a)、(b)和(C)中的定容采用緩沖液或二蒸水進行，所述PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液或磷酸二氫鈉緩沖液。優選的，所述緩沖液為PBS緩沖液。其pH值為7. 2。與之相應的另一種技術方案，，包括如下步驟 (a)向至少5個空白血漿中分別加入不同量的亞甲藍溶液，并加入羧甲基-￠-環糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍系列濃度的血漿標準樣本，采用熒光分光光度計進行檢測，測得一系列熒光峰強度或熒光峰面積；(b)向含亞甲藍的待測血漿樣本中加入羧甲基-￠-環糊精飽和溶液，加入濃度與上述空白血漿樣本相同，定容，得含亞甲藍濃度為Cx的血漿待測樣本，采用熒光分光光度計進行檢測，測得熒光峰強度或熒光峰面積為Fx ； 按標準曲線法計算即可得到待測血漿樣本中的亞甲藍濃度Cx ； 所述步驟(a)和(b)中采用的熒光分光光度計進行檢測的條件相同，激發波長為665±8nm，發射波長掃描范圍為67(T715nm，激發狹縫寬度2 10nm，發射狹縫寬度2 lOnm，掃描速度IOO lOOOnm/min,激發光程2 IOmm,發射光程2 10mm。上述技術方案中，在步驟(a)之前，還進行如下步驟(C):向空白血漿中加入羧甲基-P -環糊精飽和溶液，使其濃度為廣4. 5mmol/L,定容，得血漿空白樣本，采用熒光分光光度計進行檢測，測得熒光峰強度或熒光峰面積為Fo。 上文中，所述向空白血漿中加入羧甲基-￠-環糊精飽和溶液，使其濃度為1^4. 5mmol/L,這里的濃度是指加入羧甲基-P -環糊精飽和溶液之后的血漿中的羧甲基-￠-環糊精的摩爾濃度。上文中，按標準曲線法計算待測血漿樣本中的亞甲藍濃度時，其中的熒光信號可以扣除基底，也可以不扣除基底。上述技術方案中，所述步驟(a)、(b)和(C)中的定容采用緩沖液或二蒸水進行，所述緩沖液為PBS緩沖本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種檢測血漿中亞甲藍含量的方法，其特征在于，包括如下步驟 (a)向空白血漿中加入羧甲基-￠-環糊精飽和溶液，使其濃度為f4.5mmol/L，定容，得血漿空白樣本，采用熒光分光光度計進行檢測，測得熒光峰強度或熒光峰面積為Fo ； (b)向空白血漿中加入定量的亞甲藍溶液，并加入羧甲基-￠-環糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍濃度為Cs的血漿標準樣本，采用熒光分光光度計進行檢測，測得熒光峰強度或熒光峰面積為Fs ； (C)向含亞甲藍的待測血漿樣本中加入羧甲基-￠-環糊精飽和溶液，加入濃度與上述血漿空白樣本相同，定容，得含亞甲藍濃度為Cx的血漿待測樣本，采用熒光分光光度計進行檢測，測得熒光峰強度或熒光峰面積為Fx ； 然后按對照品比較法計算即可得到待測血漿樣本中的亞甲藍濃度Cx ； 所述步驟(a)、(b)和(C)中采用的熒光分光光度計進行檢測的條件相同，激發波長為665±8nm，發射波長掃描范圍為67(T715nm，激發狹縫寬度2 10nm，發射狹縫寬度2 10nm，掃描速度100 1000nm/min,激發光程2 IOmm,發射光程2 10mm。2.根據權利要求I所述的檢測血漿中亞甲藍含量的方法，其特征在于所述步驟(a)、(b)和(c)中的定容采用緩沖液或二蒸水進行，所述緩沖液為PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液或磷酸二氫鈉緩沖液。3.根據權利要求2所述的檢測血漿中亞甲藍含量的方法，其特征在于所述緩沖液為PBS緩沖液。4.一種檢測血漿中亞甲藍含量的方法，其特征在于...
【專利技術屬性】
技術研發人員：謝洪平，周群剛，謝蓮，唐建華，方敏，徐軍，王明元，
申請(專利權)人：蘇州市中心血站，蘇州大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。