【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物傳感器，涉及一種利用納米酶促電活性分子二茂鐵-酪胺沉積反應放大檢測信號的電化學免疫傳感器及其制備方法和應用。
技術介紹
1、肝細胞癌的死亡率幾乎和發病率持平，是影響人類健康的最大威脅之一，肝細胞癌危險因素多，早期癥狀隱匿，預后差等原因使其患者發病率逐年增加。因此，探索靈敏、快速、特異的新型肝癌標志物和檢測工具對肝細胞癌的早期監測和診斷尤其重要。衰老標記蛋白-30(smp30)，又稱調節鈣蛋白，主要以正常人肝細胞和腎小管上皮細胞中表達為主，而在hcc組織中smp30的表達量低于hcc癌旁組織。雖然，傳統的腫瘤標志物是由癌細胞直接產生的，但腫瘤能夠誘導機體發生免疫反應，產生抗腫瘤相關抗原的自身抗體，該抗體表達水平同腫瘤發展密切相關，能夠在腫瘤相關抗原濃度低的情況下作為腫瘤的診斷標志物相關研究表明，smp30抗體在afp陰性的早期肝癌中有顯著的陽性表達，因此，smp30抗體被認為是肝細胞癌的一個有吸引力的新型靶點，可作為追蹤、診斷早期肝癌的可靠腫瘤標志物。
2、納米酶是指尺寸在納米結構范圍，由單組分的納米材料制備的人造酶。它表現出類似天然酶的催化性能和其獨特的穩定性，同時還能夠根據使用條件對其表面結構進行修改。在過去的幾十年，已有各種類型納米酶被設計，根據其組分和催化活性機制，主要分為金屬粒子納米酶、金屬化合物納米酶、非金屬納米酶和其它類型：(i)金、銀、鉑和鈀等金屬納米粒子組成的納米酶，這類納米酶對非均相反應表現出良好的催化性能，在不做任何修飾的情況下表現出超高的類過氧化物酶活性。其催化過程與ph、底物
3、用于檢測腫瘤標志物的生物傳感器因其結果可靠、分析速度快而被廣泛應用于分子診斷。然而，大多數腫瘤標志物為惰性的蛋白質分子，在檢測過程中很難被直接檢測。酶通常被標記在識別探針上作為酶催化信號放大的外源信號分子，在三明治型生物傳感系統中起到關鍵作用。二茂鐵(fc)是一種由兩個環戊二烯基環連接中心鐵原子構成的有機過渡金屬化合物，具有可逆的氧化還原狀態和較高的電化學活性，是一種理想的電信號分子。因此，為了進一步提高分析目標分子的傳感器性能，基于fc及其衍生物的電活性分子被廣泛用于電子傳遞介質的生物傳感器構建中。近年來，基于酶催化信號放大技術，已有大量報道用于超靈敏痕量分析的生物傳感器。酪胺信號放大(tsa)是早期通過原位擴增來增強熒光免疫組化分析的技術。目前，其原位擴增的特點被廣泛應用到傳感器策略中，其反應原理中酶在h2o2存在下催化酪胺形成共價結合位點，新加入的酪胺及其復合物可短時間內與之穩定結合，促使原始信號幾何放大。
4、目前尚未有合成了一種新型二茂鐵基的電活性物質二茂鐵酪作為電活性探針開發了一個用于特異性檢測肝癌標志物gpc3的生物傳感分析平臺的報道。
技術實現思路
1、本專利技術的專利技術目的是，針對上述問題，提供了一種利用納米酶促電活性分子二茂鐵-酪胺沉積反應放大檢測信號的電化學免疫傳感器及其制備方法和應用，以首先以鼠源單克隆抗體為分析物，基于96孔板的獨立免疫反應和納米酶go-hemin催化二茂鐵酪胺沉積反應，提出了一種用于檢測肝癌腫瘤標志物smp30抗體的分體式生物傳感器模型。并探究了其可行性，隨后利用該傳感器模型對smp30抗體進行定量分析。在靶標物質存在的情況下，納米酶高效、穩定、快速的酶催化活性與氧化還原性能優異的二茂鐵酪胺協同作用，使大量的電活性物質二茂鐵酪胺沉積在電極表面，電流信號輸出值發生顯著改變。該分體式生物傳感器特異、靈敏的分析性能實現了smp30抗體的快速檢測，也為其它腫瘤標志物的傳感分析提供新思路。
2、為達到上述目的，本專利技術所采用的技術方案是：
3、利用納米酶促電活性分子二茂鐵-酪胺沉積反應放大檢測信號的電化學免疫傳感器，所述電化學免疫傳感器是基于96孔板和納米酶催化電活性分子二茂鐵-酪胺沉積信號放大的超靈敏分體式生物傳感器，將電活性分子二茂鐵-酪胺作為信號放大元件，標記于信號抗體，通過捕獲抗體探針、目標抗原和信號抗體之間的夾心免疫反應，實現電流檢測信號的顯著放大和對目標抗原的靈敏檢測。
4、本專利技術還提供一種入上述所述的電化學免疫傳感器的制備方法，具體包括以下步驟：
5、(1)制備免疫復合物go/hemin-ab2：
6、s1、將羧基化氧化石墨烯溶于超純水中，超聲分散，離心，取上清液，
7、s2、接著再將氯化血紅素溶于二甲基甲酰胺中，與步驟s1得到的上清液混合，超聲處理，再通過離心將沉淀物和上清液分離，pbs緩沖液洗滌2次，在烘箱中干燥得到go/hemin，然后，將得到的氯化血紅素功能化的go/hemin分散到超純水中，超聲后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，室溫下攪拌，再加入多克隆抗體，反應，然后離心分離上清和沉淀，用pbs洗滌，最后在真空干燥機中干燥后置于pbs溶液重懸，制備最終的免疫復合物go/hemin-ab2，備用；
8、(2)制備ge/au?nps/mpa/tyr修飾的金電極：
9、1)用氧化鋁勻漿拋光金電極，將打磨干凈的金電極放入無水乙醇中超聲清洗，接著在超純水中超聲清洗，如此交替超聲，重復3次；
10、2)將三電極系統同時置于0.5m?h2so4溶液中進行電化學清洗，采用電化學循環伏安法慢掃，再進行電解池充放電，將電解池接通，接著進行cv快掃，最后再次進行cv慢掃，以上操作重復兩次，ddh2o洗滌三次；
11、3)將ge浸入haucl4溶液中，電沉積au?nps，形成au?nps修飾的ge/au?nps，將ge/aunps在3-巰基丙酸中孵育過夜，得ge/au?nps/mpa，將edc-nhs溶液滴在ge/au?nps/mpa表面室溫孵育，接著將tyr溶液滴加到ge/au?nps/mpa表面，在室溫下孵育，利用羧基與氨基的縮合反應，將酪胺固定在電極表面，用水沖洗后，獲得au?nps/mpa/tyr修飾的金電極(ge/aunps/mpa/tyr)；
12、(3)室溫下孵育目標ag，以使ab1與ag發生特異性免疫反應；再滴加步驟(1)制備好的g本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.利用納米酶促電活性分子二茂鐵-酪胺沉積反應放大檢測信號的電化學免疫傳感器，其特征在于：所述電化學免疫傳感器是基于96孔板和納米酶催化電活性分子二茂鐵-酪胺沉積信號放大的超靈敏分體式生物傳感器，將電活性分子二茂鐵-酪胺作為信號放大元件，標記于信號抗體，通過捕獲抗體探針、目標抗原和信號抗體之間的夾心免疫反應，實現電流檢測信號的顯著放大和對目標抗原的靈敏檢測。
2.一種如權利要求1所述的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于：具體包括以下步驟：(1)制備免疫復合物GO/Hemin-Ab2：S1.將羧基化氧化石墨烯溶于超純水中，超聲分散，離心，取上清液，S2.接著再將氯化血紅素溶于二甲基甲酰胺中，與步驟S1得到的上清液混合，超聲處理，再通過離心將沉淀物和上清液分離，PBS緩沖液洗滌2次，在烘箱中干燥得到GO/Hemin，然后，將得到的氯化血紅素功能化的GO/Hemin分散到超純水中，超聲后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下攪拌，再加入多克隆抗體，反應，然后離心分離上清和沉淀，用PBS洗滌，最后在真空干燥機中干燥后置于PBS溶液重懸，
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：在步驟S1中，所述羧基化氧化石墨烯與超純水的比例為1mg：1mL，超聲分散3h以上，3000rpm離心30min。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：在步驟S2中，所述氯化血紅素用量為26.076mg、二甲基甲酰胺用量為4mL，超聲處理是室溫條件下130KHz進行3h，再通過13000rpm離心30min將沉淀物和上清液分離；所述GO/Hemin與超純水的比例為1mg：mL；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)用量為500μL，室溫下攪拌4h，再加入30μL濃度為1mg/mL的多克隆抗體，整個混合物體系在4℃下震蕩反應24h，然后4℃、3000rpm離心30min分離上清和沉淀，用PBS洗滌2次，最后在真空干燥機中干燥12h后置于2mL0.01M的PBS溶液重懸，制備最終的免疫復合物GO/Hemin-Ab2，并在4℃下保存備用。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：在步驟1)中，所述氧化鋁勻漿的細度大小為0.3μm和/或0.05μm；所述超聲清洗均為5min。
6.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：在步驟2)中，所述三電極系統包括金電極、鉑絲對電極、Ag/AgCl參比電極。
7.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：在步驟2)中，所述電化學循環伏安法慢掃的掃描范圍為-0.25～1.5V，掃描速率為100mV/s；電解池接通的電壓為2V，5s和-0.25V，10s；所述CV快掃的掃描范圍為-0.25～1.5V，掃描速率為400mV/s。
8.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：在步驟3)中，具體操作是將第一步中預處理好的金電極(GE)浸入HAuCl4溶液中，在-0.5V電勢下電沉積AuNPs120s，形成AuNPs修飾的GE/AuNPs，并用水沖洗電極3次，將GE/AuNPs在300μL10mM3-巰基丙酸...
【技術特征摘要】
1.利用納米酶促電活性分子二茂鐵-酪胺沉積反應放大檢測信號的電化學免疫傳感器，其特征在于：所述電化學免疫傳感器是基于96孔板和納米酶催化電活性分子二茂鐵-酪胺沉積信號放大的超靈敏分體式生物傳感器，將電活性分子二茂鐵-酪胺作為信號放大元件，標記于信號抗體，通過捕獲抗體探針、目標抗原和信號抗體之間的夾心免疫反應，實現電流檢測信號的顯著放大和對目標抗原的靈敏檢測。
2.一種如權利要求1所述的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于：具體包括以下步驟：(1)制備免疫復合物go/hemin-ab2：s1.將羧基化氧化石墨烯溶于超純水中，超聲分散，離心，取上清液，s2.接著再將氯化血紅素溶于二甲基甲酰胺中，與步驟s1得到的上清液混合，超聲處理，再通過離心將沉淀物和上清液分離，pbs緩沖液洗滌2次，在烘箱中干燥得到go/hemin，然后，將得到的氯化血紅素功能化的go/hemin分散到超純水中，超聲后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺，室溫下攪拌，再加入多克隆抗體，反應，然后離心分離上清和沉淀，用pbs洗滌，最后在真空干燥機中干燥后置于pbs溶液重懸，制備最終的免疫復合物go/hemin-ab2，備用；(2)制備ge/aunps/mpa/tyr修飾的金電極：1)用氧化鋁勻漿拋光金電極(ge)，將打磨干凈的ge放入無水乙醇中超聲清洗，接著在超純水中超聲清洗，如此交替超聲，重復3次；2)將三電極系統同時置于0.5mh2so4溶液的電解槽中進行電化學清洗，采用電化學循環伏安法慢掃，再進行電解池充放電，將電解池接通，接著進行cv快掃，最后再次進行cv慢掃，以上操作重復兩次，ddh2o洗滌三次；3)將在第一步中處理好的ge浸入haucl4溶液中，電沉積aunps，形成aunps修飾的ge/aunps，將ge/aunps在3-巰基丙酸中孵育過夜，得ge/aunps/mpa，將edc-nhs溶液滴在ge/aunps/mpa表面室溫孵育，接著將tyr溶液滴加到ge/aunps/mpa表面，在室溫下孵育，利用羧基與氨基的縮合反應，將酪胺固定在電極表面，用水沖洗后，獲得aunps/mpa/tyr修飾的金電極(ge/aunps/mpa/tyr)；(3)室溫下孵育目標ag，以使ab1與ag發生特異性免疫反應；再滴加步驟(1)制備好的go-hemin-ab2孵育1h，然后將14μl1mg.ml-1fc-tyr、14μl1mg.ml-1tyr、14μl50mmh2o2組合成的混合溶液繼續滴入，同時將步驟(2)獲得的ge/aunps/mpa/tyr也加入，在37℃中持續反應30min，即可得到所述的電化學免疫傳感器。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：在步驟s1中，所述羧基化氧化石墨烯與超純水的比例為1mg：1ml，超聲分散3h以上，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙永祥，虞先濬，黃勇，鐘莉娉，何堅，施思，徐近，王旭，
申請(專利權)人：廣西醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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