一種采用超順磁性納米顆粒分離組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及納米材料領(lǐng)域，具體說是一種采用超順磁性納米顆粒分離組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)的方法。將鋅離子修飾的超順磁性納米顆粒投加于待分離溶液中，并于磁力作用下，鋅離子修飾的納米顆粒中鋅離子螯合待分離溶液中組氨酸標(biāo)簽蛋白，即可吸附分離出待分離溶液中的組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)。本發(fā)明專利技術(shù)方法通過簡單、廉價的方法實現(xiàn)了顆粒修飾，通過簡便、快速的方法實現(xiàn)了組氨酸標(biāo)簽蛋白的選擇性分離純化。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及納米材料領(lǐng)域，具體說是一種采用超順磁性納米顆粒分離組氨酸標(biāo)簽 蛋白質(zhì)的方法。
技術(shù)介紹
生物工程，是20世紀(jì)70年代初開始興起的一門新興的綜合性應(yīng)用學(xué)科，90年代 誕生了基于系統(tǒng)論的生物工程，從生物技術(shù)的角度定義生物工程就是應(yīng)用生命科學(xué)及工程 學(xué)的原理，借助生物體作為反應(yīng)器或用生物的成分作工具以提供產(chǎn)品來為社會服務(wù)的生物 技術(shù)，包括基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶工程等。信息技術(shù)的發(fā)展改變了人類的生活方 式，而生物工程的突破將幫助人類延年益壽。例如，許多活性蛋白的生產(chǎn)是從生物組織中提 取的，受材料來源限制產(chǎn)量有限，其價格往往十分昂貴。而微生物生長迅速，容易控制，適于 大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應(yīng)蛋白成分的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞內(nèi)，讓它們產(chǎn)生相 應(yīng)的蛋白，不但能解決產(chǎn)量問題，還能降低生產(chǎn)成本。在生物合成過程中，為目的蛋白引入 合適的親和層析純化標(biāo)簽，不僅不會影響蛋白的生物活性，而且可以大大簡化純化步驟。作 為目前最常用的一種蛋白標(biāo)簽，組氨酸標(biāo)簽具有多種優(yōu)點(diǎn)只有6個組氨酸，分子量很小， 一般不需要用酶切去除；可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能夠保持 結(jié)合力；無免疫原性，重組蛋白可直接用來注射動物，也不影響免疫學(xué)分析；可以方便的用 固定金屬離子親禾口色譜(Immobilized Metal-ionaff inity chromatography, I MAC)純化。IMAC是Porath et al. 1975年用固定IDA作為配基的填料螯合過渡金屬銅、鎳、 鈷或鋅離子，可以吸附純化表面帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白。1987年Smith et al.發(fā)現(xiàn)帶有幾個組氨酸或色氨酸小肽和螯合金屬離子的IDA-s印hadex G-25作用力更 強(qiáng)，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-Si5phadex G-25親和純化在氨基端帶組氨酸 和色氨酸的胰島素原。同年1987年Hochuli et al.發(fā)現(xiàn)帶有相連組氨酸的多肽和Ni2+-NTA 填料作用力更強(qiáng)于普通的肽，1988年他第一次用這樣的方法純化了帶六個組氨酸標(biāo)簽的多 肽，無論是在天然還是變性條件下一次親和純化都得到很好效果，此后表達(dá)帶六個組氨酸 標(biāo)簽的蛋白配合IMAC變得非常普遍，相對而言，不帶標(biāo)簽的蛋白純化就非常困難，所以表 達(dá)帶六個組氨酸標(biāo)簽的蛋白配合IMAC純化變成最常用而且最有效的研究蛋白結(jié)構(gòu)和功能 的有力手段。目前的IMAC柱層析技術(shù)雖然有這么多的優(yōu)點(diǎn)，但是它仍然具有傳統(tǒng)色譜層析技 術(shù)共有的缺點(diǎn)，即不能直接處理發(fā)酵液或細(xì)胞破碎勻漿液，因為原料液中的固體顆粒會堵 塞層析柱，必須預(yù)先采用高速離心或微濾方法除去細(xì)胞或細(xì)胞碎片。這種分離模式分離時 間長，成本高，而且在固體顆粒的分離中往往會有一定的活性損失。另外，傳統(tǒng)層析是將事 先制備好的顆粒狀介質(zhì)填充在層析柱中進(jìn)行分離純化的。由于顆粒粒的不均勻性和顆粒內(nèi) 外的擴(kuò)散阻力，導(dǎo)致洗脫峰峰展寬，分離效率下降。層析分離效率或理論塔板高度與流動相 流速關(guān)系很大，存在一個流速極值點(diǎn)(這個流速實際很低)、高于這個流速時，理論塔板高 度增大，分離效率下降。而且由于顆粒內(nèi)擴(kuò)散導(dǎo)致蛋白質(zhì)實際動態(tài)吸附容量很低。近年來，生物技術(shù)的迅速發(fā)展對目標(biāo)產(chǎn)品的分離純化技術(shù)提出了更新和更高的要求。除了層析床柱 的設(shè)計之外，新型吸附介質(zhì)的開發(fā)和制備也成為蛋白質(zhì)分離中一個關(guān)鍵的研究領(lǐng)域。傳統(tǒng) 的多孔吸附介質(zhì)面對蛋白質(zhì)等大分子的分離表現(xiàn)出了諸多的不足。例如，分離過程生物大 分子特別是細(xì)胞碎片對吸附載體的相互作用很容易引起分離時間的延長甚至是柱堵塞；吸 附載體孔徑的增大縮短分離時間的同時又會導(dǎo)致分離效率的降低；減小吸附介質(zhì)尺寸增大 了分離效率但是又帶來了吸附介質(zhì)難分離的問題。在由此可見，如何制備選擇性高、擴(kuò)散阻 力小、表面積大而且又方便回收再生的吸附介質(zhì)成為目前蛋白質(zhì)分離中需要研究的問題。20世紀(jì)80年代，隨著掃描隧道顯微鏡(STM)、原子力顯微鏡(AFM)等微觀表征和 操縱技術(shù)的誕生與發(fā)展，納米技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。其中，納米顆粒作為一種新型的生物分離介 質(zhì)，具有較大的比表面積，同時又避免了常規(guī)網(wǎng)狀分離介質(zhì)內(nèi)部擴(kuò)散阻力的限制，在蛋白質(zhì) 分離中體現(xiàn)了很好的應(yīng)用潛力。磁性納米顆粒基于其獨(dú)特的磁響應(yīng)特性、較大的比表面積 和較好的生化活性，為生物分離帶來了一種全新的納米介質(zhì)。當(dāng)磁性納米顆粒表面修飾上 抗體、寡核苷酸等生物探針，就可以迅速靶向結(jié)合目標(biāo)物，在外加磁場作用下，可以很方便 的將磁性納米顆粒從底液中分離出來，大大縮短了樣品的分析時間，這一新穎的分離方法 克服了傳統(tǒng)分離方法的不足，使分離效率大大提高，同時磁性納米顆粒應(yīng)用于生化分析工 作中，還能使樣品的痕量組分最大限度地富集起來，使分離和富集過程同步進(jìn)行，非常適用 于樣品中痕量組分的檢測，尤其對于大批量樣品的分離檢測，磁性納米顆粒更是表現(xiàn)出優(yōu) 越。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于提供。為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案為將鋅離子修飾的超順 磁性納米顆粒投加于待分離溶液中，并于磁力作用下，鋅離子修飾的納米顆粒中鋅離子螯 合待分離溶液中組氨酸標(biāo)簽蛋白，即可吸附分離出待分離溶液中的組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)。所述鋅離子修飾的超順磁性納米顆粒將每毫升0. 5-lmM硫酸鋅水溶液中加入 10-20mg超順磁性納米顆粒中超聲分散5-lOmin而后室溫下振蕩30-60min，即得到鋅離子 修飾超順磁性硅殼納米顆粒，待用。所述鋅離子修飾的超順磁性納米顆粒作用于待分離溶 液是將上述所得3-5mg鋅離子修飾超順磁性硅殼納米顆粒加入到0. 5-lml待分離溶液中于 室溫下振蕩30-60min，并于磁力作用下進(jìn)行分離待分離溶液。所述鋅離子修飾的納米顆粒 中鋅離子螯合待分離溶液中組氨酸標(biāo)簽蛋白，將螯合有組氨酸標(biāo)簽蛋白的納米粒子加入到 每升PBS緩沖液中含有500mM的咪唑溶液內(nèi)于室溫下振蕩10-30min，即將組氨酸標(biāo)簽蛋白 質(zhì)從納米顆粒上解離下來，而后再在磁力作用下將納米顆粒分離出。本專利技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比較，該方法將分離和富集結(jié)合于一 體，利用超順磁性硅殼納米顆粒較大的比表面，提高了分離過程中顆粒與蛋白質(zhì)分子間的 作用速度；利用顆粒的超順磁性，降低了分離過程的操作強(qiáng)度；利用顆粒表面的硅殼材料 對鋅離子的吸附作用，實現(xiàn)了顆粒表面的鋅離子修飾；利用鋅離子與組氨酸之間的螯合作 用，實現(xiàn)了對組氨酸標(biāo)簽蛋白的選擇性結(jié)合；利用咪唑與組氨酸之間對鋅離子螯合的競爭 作用，實現(xiàn)了顆粒結(jié)合組氨酸標(biāo)簽蛋白的洗脫。本專利技術(shù)方法通過簡單、廉價的方法實現(xiàn)了顆粒修飾，通過簡便、快速的方法實現(xiàn)了組氨酸標(biāo)簽蛋白的選擇性分離純化。 附圖說明圖1為本專利技術(shù)實施例鋅離子修飾超順磁性硅殼納米顆粒透射電鏡照片(其中Bar =IOOnm)。圖2為本專利技術(shù)實施例鋅離子修飾超順磁性硅殼納米顆粒對組氨酸標(biāo)簽別藻藍(lán)蛋 白α、β亞基分離電泳佐證圖(其中電泳中各泳道分別為1、解離所得蛋白，2、Marker，3、 菌體破碎液，4、磁分離上清)。圖3為本專利技術(shù)實施例鋅離子修飾超順磁性硅殼納米顆粒對組氨酸標(biāo)簽別藻藍(lán)蛋 白α、β亞基分離電泳W(wǎng)estern blotting分析圖(其中電泳中各泳道分別為1、解離所得 蛋白，2、Marker，3、本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種采用超順磁性納米顆粒分離組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)的方法，其特征在于：將鋅離子修飾的超順磁性納米顆粒投加于待分離溶液中，并于磁力作用下，鋅離子修飾的納米顆粒中鋅離子螯合待分離溶液中組氨酸標(biāo)簽蛋白，即可吸附分離出待分離溶液中的組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)。

【技術(shù)特征摘要】
一種采用超順磁性納米顆粒分離組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)的方法，其特征在于將鋅離子修飾的超順磁性納米顆粒投加于待分離溶液中，并于磁力作用下，鋅離子修飾的納米顆粒中鋅離子螯合待分離溶液中組氨酸標(biāo)簽蛋白，即可吸附分離出待分離溶液中的組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)。2.按權(quán)利要求1所述的采用超順磁性納米顆粒分離組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)的方法，其特 征在于所述鋅離子修飾的超順磁性納米顆粒將每毫升0. 5-lmM硫酸鋅水溶液中加入 10-20mg超順磁性納米顆粒中超聲分散5-lOmin而后室溫下振蕩30-60min，即得到鋅離子 修飾超順磁性硅殼納米顆粒，待用。3.按權(quán)利要求1所述的采用超順磁性納米顆粒分離組氨...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳英杰，秦松，崔玉琳，郭雪潔，姜鵬，陳華新，李富超，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院海洋研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：95[中國|青島]