酰乙基苯丙氨酸型鎳親合層析介質在純化融合蛋白中的應用制造技術

本發明專利技術涉及一種酰乙基苯丙氨酸型鎳親合層析介質（ＰＳ－Ｐｈｅ－Ｎｉ↑［２＋］）在純化融合蛋白中的應用。該介質對蛋白的純化效果較好，且粗酶液不經過硫酸銨沉淀、透析等預處理，可直接用于親合純化，簡化了純化工藝。其主要步驟為：將融合蛋白溶液加入ＰＳ－Ｐｈｅ－Ｎｉ↑［２＋］親合層析介質中進行親合吸附；用１０－４００ｍＭ咪唑濃度的磷酸緩沖液對介質進行梯度洗脫，收集每個濃度的洗脫液，經酶活測定并取微量用丙酮沉淀過夜后，進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳觀察目的蛋白的洗脫位置及雜蛋白的洗脫情況。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種酰乙基苯丙氨酸型鎳親合層析介質在純化融合蛋白中的應用，屬于蛋 白純化技術。
技術介紹
酶催化法合成手性藥物由于具有耗資少、污染小等一系列優點，市場前景廣闊。隨著 基因工程的發展，大量的酶可以通過克隆表達獲得，而融合蛋白的純化是酶催化法合成手 性藥物的前提。金屬螯合親合層析作為一種常用的蛋白純化手段，在融合蛋白的純化中被 廣泛應用。該方法利用蛋白質鏈末端的一些氨基酸，例如組氨酸、色氨酸、賴氨酸等能與 金屬離子發生特殊的相互作用的原理對蛋白質加以分離、純化。常規的金屬螯合親合層析介質多以葡聚糖或瓊脂糖等軟基質作為載體，但這些介質價 格昂貴、配基的制備困難、偶聯條件激烈，且在制備時常使用溴化氰等劇毒試劑，須采取 特殊防護措施。而聚苯乙烯(Polystyrene， PS)作為載體，具有原料來源廣泛、價廉且易功能 化等優點。已有研究者采用PS作為載體，通過氯甲基功能化制得氯甲基聚苯乙烯 (PS-CH2-C1)介質，再胺化后引入氨基酸及氯乙酸或氯乙酰氯及亞胺二乙酸(IDA)等配體， 最后與金屬離子形成三齒的五元螯合環，制備獲得金屬螯合親合層析介質。該方法除具有 在合成氯甲基化親和層析介質中通常要用到有強致癌性的氯甲醚或二氯甲醚等原料，及苯 環氯甲基化反應常伴有氯甲基的多取代和二次交聯，會影響親和層析介質的性能外，其合 成制備金屬螯合環的步驟過于復雜。
技術實現思路
本專利技術的目的是采用一種酰乙基苯丙氨酸型鎳親合層析介質(PS-Phe-N產)來有效的 純化融合蛋白的方法。由該PS-Phe-N產親合層析介質純化融合蛋白的技術方案包括以下步驟(1) 將融合蛋白溶液加入PS-Phe-N產親合層析介質中進行親合吸附；(2) 用不同咪唑濃度的緩沖液對上述親合層析介質進行梯度洗脫，收集每個濃度的洗 脫液，測定酶活并取微量經丙酮沉淀過夜，進行SDS-PAGE電泳觀察目的蛋白的洗脫位置 及雜蛋白的洗脫情況。本專利技術的優點以氯乙酰化聚苯乙烯(PS-Acyl-Cl)為載體，固載苯丙氨酸(Phe)和螯合 鎳離子(N產)，只需兩步反應即可制備這種親合層析介質(PS-Phe-N產)，而上述PS-CH2-C1 親和層析介質的制備方法至少需要4步。本專利技術方法所用親合介質制備方法簡單，成本低廉， 并克服了氯甲基化親和層析介質制備過程中使用致癌物氯甲醚的弊端。將其應用于純化融合 蛋白，結果表明該親和層析介質對蛋白的純化效果良好，且粗酶液不經過硫酸銨沉淀、透析 等預處理，直接可用于親合純化，簡化了純化工藝。具體實施方案實施例l稱量0.15gPS-Phe-N產親合層析介質，用具塞錐形瓶盛放，加入20% (V/V，下同)的 乙醇水溶液10mL溶脹該介質12h。然后用磷酸緩沖液多次置換20%的乙醇溶液，去除介 質中的乙醇。用50mM pH 7.4的磷酸緩沖液將介質全部轉移到10mL的離心管中，轉移完畢之后將 管中的磷酸緩沖液吸凈，再加入5mL濃度為11.52 mg/mL的醛糖還原酶，用封口膜封口。 將離心管固定在搖床上。將搖床置于4'C層析柜中，開啟電源，使管內介質在蛋白溶液中適 度晃動12h。吸附結束，測定醛糖還原酶濃度為7.23mg/mL。將介質轉移至吸附柱中，分別用10、 20、 50、 100、 200、 300、 400 mM咪唑濃度的磷酸緩沖液洗滌介質2-3次，收集每個濃度 的洗脫液，測定酶活并取微量洗脫液經丙酮沉淀過夜，進行SDS-PAGE電泳觀察目的蛋白 的洗脫位置及雜蛋白的洗脫情況。親和層析介質對醛糖還原酶的吸附量為143.00 mg/g，酶 活回收率達到80%，純化后的融合蛋白純度達到98%，純化倍數達到30倍。實施例2稱量0.15gPS-Phe-Ni"親和層析介質，用具塞錐形瓶盛放，加入20X的乙醇溶液10mL 溶脹該介質lh。然后用50mMpH7.4的磷酸緩沖液多次置換20X的乙醇，去凈介質中的乙 醇。用50mM pH 7.4的磷酸緩沖液將介質全部轉移到10mL的離心管中，轉移完畢之后將 管中的磷酸緩沖液吸凈，再加入5mL濃度為8.60mg/mL的醛糖還原酶，用封口膜封口。將 離心管固定在搖床上。將搖床置于4'C層析柜中，開啟電源，使管內介質在蛋白溶液中適度 晃動12h。吸附結束，測定醛糖還原酶濃度為5.37mg/mL。將親和層析介質轉移至吸附柱中，分 別用10、 20、 50、 100、 200、 300、 400 mM咪唑濃度的磷酸緩沖液洗滌介質2-3次，收集 每個濃度的洗脫液，測定酶活并取微量經丙酮沉淀過夜，進行SDS-PAGE電泳觀察目的蛋 白的洗脫位置及雜蛋白的洗脫情況。親和層析介質對醛糖還原酶的吸附量為107.70mg/g， 酶活回收率達到65%，純化后的融合蛋白純度達到70%，純化倍數達到21倍。實施例3稱量0,20gPS-Phe-N產親和層析介質，用具塞錐形瓶盛放，加入20%的乙醇溶液10mL 溶脹該介質8h。然后用50mMpH7.4的磷酸緩沖液多次置換20X的乙醇，去凈介質中的乙 醇。用50mMpH7.4的磷酸緩沖液將介質全部轉移到10ml的離心管中，轉移完畢之后將管 中的磷酸緩沖液吸凈，再加入5mL濃度為10.05 mg/mL的六聚組氨酸融合蛋白CD155D， 用封口膜封口。將離心管固定在搖床上。將搖床置于4X:層析柜中，開啟電源，使管內介質 在蛋白溶液中適度晃動12h。吸附結束，測定六聚組氨酸融合蛋白CD155D濃度為6.12mg/mL。將介質轉移至吸附 柱中，分別用50、 100、 200、 300、 400 mM咪唑濃度的磷酸緩沖液洗漆介質2-3次，收集 每個濃度的洗脫液，測定酶活并取微量經丙酮沉淀過夜，進行SDS-PAGE電泳觀察目的蛋 白的洗脫位置及雜蛋白的洗脫情況。親和層析介質對醛糖還原酶的吸附量為98.25mg/g，純 化后的融合蛋白純度達到80%，酶活回收率達到75%，純化倍數達到56倍。權利要求1. 本專利技術涉及一種酰乙基苯丙氨酸型鎳(PS-Phe-Ni2+)親合層析介質在純化融合蛋白中的應用。此方法包括以下兩步(1)融合蛋白溶液加入PS-Phe-Ni2+親合層析介質中進行親合吸附；(2)用不同咪唑濃度的緩沖液對介質進行梯度洗脫，收集每個濃度的洗脫液。2. 根據權利要求l所述，其特征在于PS-Phe-N產由氯乙酰化聚苯乙烯樹脂(PS-Acyl-Cl)固 載苯丙氨酸(Phe)和金屬鎳離子(Ni2+)制得。3. 根據權利要求l所述，融合蛋白溶液可以不經硫酸銨沉淀、透析等預處理，直接用于親合 純化。4. 根據權利要求l所述，緩沖液為50mMpH7.4的磷酸緩沖液。5. 根據權利要求1所述，咪唑濃度為10-400mM。6. 根據權利要求l所述，洗脫液測定酶活，并取微量經丙酮沉淀過夜，進行SDS-PAGE電泳 觀察目的蛋白的洗脫位置及雜蛋白的洗脫情況。全文摘要本專利技術涉及一種酰乙基苯丙氨酸型鎳親合層析介質(PS-Phe-Ni²⁺)在純化融合蛋白中的應用。該介質對蛋白的純化效果較好，且粗酶液不經過硫酸銨沉淀、透析等預處理，可直接用于親合純化，簡化了純化工藝。其主要步驟為將融合蛋白溶液加入PS-Phe-Ni<sup>2+</su本文檔來自技高網...

【技術保護點】
本專利技術涉及一種酰乙基苯丙氨酸型鎳（ＰＳ－Ｐｈｅ－Ｎｉ↑［２＋］）親合層析介質在純化融合蛋白中的應用。此方法包括以下兩步：　　　　（１）融合蛋白溶液加入ＰＳ－Ｐｈｅ－Ｎｉ↑［２＋］親合層析介質中進行親合吸附；　　　　（２）用不同咪唑濃度的緩沖液對介質進行梯度洗脫，收集每個濃度的洗脫液。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉曉寧，魏榮卿，張曉曉，
申請(專利權)人：南京工業大學，
類型：發明
國別省市：84[中國|南京]