一種干細胞外泌體修復凝膠的制備方法和設備技術

本發明專利技術提供一種干細胞外泌體修復凝膠的制備方法和設備。本發明專利技術提供一種確保外泌體的活性以及穩定性的干細胞外泌體修復凝膠的制備方法和設備。一種干細胞外泌體修復凝膠的制備方法，包括有以下步驟：人臍帶間充質干細胞的提取和培養、間充質干細胞外泌體的提取、間充質干細胞外泌體的鑒定檢測和干細胞外泌體修復凝膠的制備等。本發明專利技術通過觀測帶間充質干細胞的密度以及鑒定檢測間充質干細胞外泌體的活性，從而使得制備出的干細胞外泌體修復凝膠所含有的細胞因子具有一定的活性，并且通過殼聚糖修復凝膠作為干細胞外泌體與皮膚之間的載體，確保干細胞外泌體在皮膚愈合過程中的穩定性。穩定性。穩定性。

【技術實現步驟摘要】
一種干細胞外泌體修復凝膠的制備方法和設備


[0001]本專利技術涉及醫藥
，尤其涉及一種干細胞外泌體修復凝膠的制備方法和設備。

技術介紹

[0002]干細胞療法是近幾年來用于修復皮膚受損的新興治療方式，而間充質干細胞外泌體是負責細胞旁分泌作用的關鍵活性囊泡，間充質干細胞外泌體帶有源細胞的細胞因子、生長因子、mRNA、脂質和蛋白質。
[0003]專利公開號為CN114515353A的專利公開了一種基于臍帶干細胞和臍帶干細胞外泌體的復合水凝膠、其制備方法及應用，所述的復合水凝膠包括臍帶干細胞、臍帶干細胞外泌體和凝膠材料，其中所述的臍帶干細胞、臍帶干細胞外泌體和凝膠材料的體積比為1：1：2～4。上述專利技術所提供的復合水凝膠可緩慢釋放臍帶干細胞外泌體，延長外泌體在創傷表面的駐留時間，加快傷口的修復愈合，但是上述專利技術所提供的復合水凝膠不能確保外泌體的活性以及穩定性，因此無法確保長期釋放外泌體的治療效果。
[0004]鑒于上述技術問題，需要設計出一種確保外泌體的活性以及穩定性的干細胞外泌體修復凝膠的制備方法和設備。

技術實現思路

[0005]為了克服上述專利技術所提供的復合水凝膠不能確保外泌體的穩定性，因此無法確保長期釋放外泌體的治療效果，不便于加速創面再上皮化的缺點，本專利技術提供一種確保外泌體的活性以及穩定性的干細胞外泌體修復凝膠的制備方法和設備。
[0006]本專利技術的技術方案為：
[0007]一種干細胞外泌體修復凝膠的制備方法，包括有以下步驟：
[0008]S1、人臍帶間充質干細胞的提取
[0009]取足月剖宮產的新生兒臍帶，將其浸泡在磷酸鹽緩沖液中3
?
5分鐘去除血水，取出新生兒臍帶切成2
?
3cm的片段，將新生兒臍帶片段用磷酸鹽緩沖液清洗干凈，使用無菌手術刀剪掉其上的動脈和靜脈，并且剪碎至0.5
?
2mm，通過酶消化法提取分離人臍帶間充質干細胞；
[0010]S2、人臍帶間充質干細胞的培養
[0011]將步驟S1中獲得的人臍帶間充質干細胞加入至無血清培養基中，并且將無血清培養基置于35
?
37℃，3％
?
5％CO2的細胞培養箱內，每間隔24小時，用顯微鏡觀測干細胞的密度；
[0012]S3、間充質干細胞外泌體的培養上清溶液的分離
[0013]取出步驟S2中培養一定時間后的無血清培養基，將其中的培養液取出經過三次離心后，利用0.20
?
0.25um的濾膜過濾，使得細胞、死細胞及細胞碎片過濾出，得到含有間充質干細胞外泌體的培養上清溶液；
[0014]S4、間充質干細胞外囊泡的提取
[0015]取出步驟S3中含有間充質干細胞外泌體的培養上清溶液繼續離心處理，離心溫度調節至4
?
6℃，以10000
?
12000g的離心力離心，離心時間為30
?
45分鐘，棄去上清溶液，獲得間充質干細胞外囊泡；
[0016]S5、間充質干細胞外泌體的提取
[0017]提取步驟S4中獲得的細胞外囊泡用磷酸緩沖鹽溶液重懸洗滌，再繼續離心處理，在4
?
6℃環境中，以18000
?
20000g的離心力離心，離心時間為70
?
75分鐘，棄去上清溶液，即獲得間充質干細胞外泌體；
[0018]S6、間充質干細胞外泌體的鑒定檢測
[0019]提取步驟S5中獲得的間充質干細胞外泌體，利用冷凍透射電鏡觀測間充質干細胞外泌體，若觀測到的間充質干細胞外泌體為球型，并且直徑在30
?
100nm之間，則表示所制得的間充質干細胞外泌體符合要求，進入步驟S8，若觀測到的間充質干細胞外泌體為破碎狀，則表示所制得的間充質干細胞外泌體不符合要求，進入步驟S4，重新制取間充質干細胞外泌體；
[0020]S7、殼聚糖修復凝膠的制備
[0021]精密稱取200
?
300g殼聚糖粉末，溶解于乙酸溶液中，并進行磁力攪拌，在35
?
37℃環境中，攪拌時間為4
?
5h，以制備得到殼聚糖溶液；
[0022]將1000
?
1500ml的β
?
甘油磷酸鈉水合物、500
?
700ml的去離子水和200
?
300g的NaHCO3粉末混合，通過渦旋、水浴超聲溶解，并通過0.20
?
0.25um的濾膜過濾，以制備得到含有NaHCO3的β
?
甘油磷酸鈉水合物溶液；
[0023]在0
?
4℃環境中，將含有NaHCO3的β
?
甘油磷酸鈉水合物溶液滴加至殼聚糖溶液，磁力攪拌10
?
15分鐘，得到均勻的殼聚糖修復凝膠；
[0024]S8、干細胞外泌體修復凝膠的制備
[0025]將步驟S5中獲得的間充質干細胞外泌體與步驟S7中獲得的殼聚糖修復凝膠均勻混合，即得干細胞外泌體修復凝膠。
[0026]在其中一個實施例中，步驟S2中的無血清培養基中，滴加2
?
3ml的氨甲環酸、粒細胞集落刺激因子和表皮生長因子，增加間充質干細胞的抗性。
[0027]在其中一個實施例中，步驟S3中三次離心的具體步驟包括有，
[0028]S3.1、第一次離心
[0029]在4
?
6℃環境中，以300
?
450g的離心力離心，離心時間為10
?
12分鐘，去除完整細胞；
[0030]S3.2、第二次離心
[0031]在4
?
6℃環境中，以2000
?
2100g的離心力離心，離心時間為10
?
12分鐘，去除細胞碎片；
[0032]S3.3、第三次離心
[0033]在4
?
6℃環境中，以10000
?
10500g的離心力離心，離心時間為30
?
35分鐘，去除死細胞。
[0034]在其中一個實施例中，步驟S7中的乙酸溶液濃度為350
?
500mL、0.1mol/L。
[0035]在其中一個實施例中，步驟S7中的含有NaHCO3的β
?
甘油磷酸鈉水合物與殼聚糖溶
液比例為1：7～10。
[0036]在其中一個實施例中，步驟S8中的間充質干細胞外泌體與殼聚糖修復凝膠比例為1：3～5。
[0037]一種干細胞外泌體修復凝膠的制備設備，包括有攪拌框、安裝架、第一離心機、磁力攪拌器、第二離心機、超聲波恒溫水浴器、溫度傳感器、過濾網板、連接管和閥門，攪拌框上部連接有安裝架，安裝架的左部下側連接有第一離心機，安裝架的左部上側連接有第二離心機，第二離心機與第一離心機通過連接本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種干細胞外泌體修復凝膠的制備方法，包括有以下步驟：S1、人臍帶間充質干細胞的提取取足月剖宮產的新生兒臍帶，將其浸泡在磷酸鹽緩沖液中3
?
5分鐘去除血水，取出新生兒臍帶切成2
?
3cm的片段，將新生兒臍帶片段用磷酸鹽緩沖液清洗干凈，使用無菌手術刀剪掉其上的動脈和靜脈，并且剪碎至0.5
?
2mm，通過酶消化法提取分離人臍帶間充質干細胞；S2、人臍帶間充質干細胞的培養將步驟S1中獲得的人臍帶間充質干細胞加入至無血清培養基中，并且將無血清培養基置于35
?
37℃，3％
?
5％CO2的細胞培養箱內，每間隔24小時，用顯微鏡觀測干細胞的密度；S3、間充質干細胞外泌體的培養上清溶液的分離取出步驟S2中培養一定時間后的無血清培養基，將其中的培養液取出經過三次離心后，利用0.20
?
0.25um的濾膜過濾，使得細胞、死細胞及細胞碎片過濾出，得到含有間充質干細胞外泌體的培養上清溶液；S4、間充質干細胞外囊泡的提取取出步驟S3中含有間充質干細胞外泌體的培養上清溶液繼續離心處理，離心溫度調節至4
?
6℃，以10000
?
12000g的離心力離心，離心時間為30
?
45分鐘，棄去上清溶液，獲得間充質干細胞外囊泡；S5、間充質干細胞外泌體的提取提取步驟S4中獲得的細胞外囊泡用磷酸緩沖鹽溶液重懸洗滌，再繼續離心處理，在4
?
6℃環境中，以18000
?
20000g的離心力離心，離心時間為70
?
75分鐘，棄去上清溶液，即獲得間充質干細胞外泌體；S6、間充質干細胞外泌體的鑒定檢測提取步驟S5中獲得的間充質干細胞外泌體，利用冷凍透射電鏡觀測間充質干細胞外泌體，若觀測到的間充質干細胞外泌體為球型，并且直徑在30
?
100nm之間，則表示所制得的間充質干細胞外泌體符合要求，進入步驟S8，若觀測到的間充質干細胞外泌體為破碎狀，則表示所制得的間充質干細胞外泌體不符合要求，進入步驟S4，重新制取間充質干細胞外泌體；S7、殼聚糖修復凝膠的制備精密稱取200
?
300g殼聚糖粉末，溶解于乙酸溶液中，并進行磁力攪拌，在35
?
37℃環境中，攪拌時間為4
?
5h，以制備得到殼聚糖溶液；將1000
?
1500ml的β
?
甘油磷酸鈉水合物、500
?
700ml的去離子水和200
?
300g的NaHCO3粉末混合，通過渦旋、水浴超聲溶解，并通過0.20
?
0.25um的濾膜過濾，以制備得到含有NaHCO3的β
?
甘油磷酸鈉水合物溶液；在0
?
4℃環境中，將含有NaHCO3的β
?
甘油磷酸鈉水合物溶...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張磊升，朱軍輝，韓之海，
申請(專利權)人：福建漢氏聯合干細胞科技有限公司，
類型：發明
國別省市：