一種抗VEGF的單克隆抗體及其制備方法和應用技術

本發(fā)明專利技術屬于生物醫(yī)藥抗體領域，更具體地，本發(fā)明專利技術公開了一種抗VEGF的單克隆抗體及其制備方法和應用。本發(fā)明專利技術的抗VEGF單克隆抗體具有良好的生物活性，能夠有效結合VEGF蛋白，并能夠在蛋白水平和細胞水平有效封閉VEGF蛋白與其受體相結合。該單克隆抗體能夠單獨或與其它抗腫瘤藥物聯(lián)合應用在腫瘤免疫治療以及腫瘤的診斷和篩查中，具有制備治療腫瘤、抗自身免疫性疾病等藥物的良好前景。

A monoclonal antibody against vascular endothelial growth factor and its preparation and Application

The invention belongs to the field of biomedical antibodies, and more specifically discloses a monoclonal antibody against vascular endothelial growth factor, a preparation method and application thereof. The anti-VEGF monoclonal antibody of the invention has good biological activity, can effectively bind to the vascular endothelial growth factor protein, and can effectively block the binding of the vascular endothelial growth factor protein to its receptor at the protein level and the cell level. The monoclonal antibody can be used alone or in combination with other anti-tumor drugs in the diagnosis and screening of tumors. It has good prospects in the preparation of drugs for the treatment of tumors and anti-autoimmune diseases.

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種抗VEGF的單克隆抗體及其制備方法和應用
本專利技術涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種抗VEGF的單克隆抗體及其制備方法和應用。
技術介紹
腫瘤的生成和發(fā)展與新血管生成有密切的聯(lián)系，通常腫瘤開始于單個異常細胞，由于與可利用毛細管床的距離非常接近，而且能在較長的一段時間里保持休眠狀態(tài)。有些腫瘤細胞可能轉向血管發(fā)生表型以激活內(nèi)皮細胞，所述內(nèi)皮細胞增殖并成熟成新的毛細血管。這些新形成的血管不僅促進原發(fā)性腫瘤繼續(xù)生長，而且使轉移性腫瘤細胞傳播并重新建群。實體瘤與正常細胞相比，新血管形成讓腫瘤細胞獲得了與正常細胞相比的生長優(yōu)勢。在乳腺癌及一些其它腫瘤中，在腫瘤組織切片中觀察到微脈管密度與患者存活之間存在一定的相關性(Weidneretal,N.Eng1.Med.324(1991)1-8:Horaketal,Lancet340(1992)1120-1124和Macchiarini,等,Lancet340(1992)145-146)。雖然尚未完全了解控制新血管發(fā)生的精確機制，但是腫瘤相關新血管的形成源自眾多血管發(fā)生刺激物與抑制物的凈平衡，參見Folkman，NatMed(1)：27-31(1995)。除腫瘤之外，新血管的發(fā)生和生成有可能與多種疾病的發(fā)生機制相關，例如：眼內(nèi)新血管綜合征，增殖性視網(wǎng)膜病或年齡相關的黃斑變性(AMD)、類風濕性關節(jié)炎和銀屑病Folkman,etal,Bio1.Chem267(1992)10931-10934；Klagsbrun,etal,Annu.Rev.Physio1.53(1991)217-239等。血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，VEGF與內(nèi)皮細胞膜上其受體，血管內(nèi)皮細胞生長因子受體（VascularEndothelialGrowthFactorReceptor）結合，引起受體的自身磷酸化，從而激活有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK），實現(xiàn)有絲分裂原特性，誘導內(nèi)皮細胞增生。VEGF是最好表征的和最強力的血管發(fā)生正調(diào)節(jié)物之一，F(xiàn)errara,N.;Kerbel，R.SNature438：967-74(2005)。C除了在血管發(fā)生和血管生成(vasculogenesis)中起到發(fā)生因子作用之外，VEGF作為多效性生長因子，還展現(xiàn)了在其它生理學過程中的多種生物學效應，諸如調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞存活、血管通透性和血管舒張、單核細胞趨化性和鈣流入等功能，F(xiàn)erraraandetal.,EndocrineRev.18：4-25(1997)。還有研究報導了VEGF對數(shù)種非內(nèi)皮細胞類型，諸如視網(wǎng)膜色素上皮細胞、胰管細胞和施旺細胞的促有絲分裂效果，Sondelletal.,J.Neurosci.19:5731-5740(1999)。VEGF作為病理學狀況中血管發(fā)生的主要調(diào)節(jié)物，使其成為了一種非常有價值的藥物靶點，針對該靶點進行了大量的工作。但是，以VEGF為靶點進行治療時，會引起涉及多種細胞因子的情況發(fā)生。例如，炎性細胞可通過分泌炎性細胞因子參與血管發(fā)生，所述炎性細胞因子可影響內(nèi)皮細胞活化、增殖、遷移和存活，相關綜述見Albini，A.，Tosetti，F(xiàn).，Benelli，R.Noonan，D.M.。與靶向VEGF和成纖維細胞生長因子信號傳導的化合物的組合治療中，不僅提高了抗腫瘤效力且延遲了晚期階段腫瘤中抗藥性的產(chǎn)生。有研究表明，腫瘤浸潤性基質成纖維細胞，可以成為促血管發(fā)生因子的來源之一Dong，J.etal.EmboJ23：2800-10(2004)等。抗VEGF中和抗體可抑制裸鼠中各種不同人腫瘤細胞系的生長(Kimetal.,(Nature)362:841-844(1993)等)，對于治療腫瘤或其他由于新血管引起的疾病，抗VEGF的單克隆抗體或其他抑制劑是一種比較好的選擇。利用單克隆抗體結合VEGF，不僅可以清除掉血液中的VEGF，還可以阻斷VEGF與VEGFR結合，阻止血管內(nèi)皮細胞增殖信號，起到抑制腫瘤血管生成的作用，達到抑制腫瘤生長之目的。人源化的單克隆抗體貝伐單抗，是一種用于腫瘤治療的抗VEGF抗體，并且是批準用于癌癥治療的一種血管生成抑制劑。然而，貝伐單抗的價格較為昂貴，該藥品在中國各省2016年-2017年組織的藥品招標采購中，最低中標價為5000多元（100mg/瓶），若某結直腸癌患者需每兩周給藥一次，每次用量3-4瓶（100mg/瓶），則患者個人僅一個月，就需在貝伐珠單抗上花費將近三、四萬元。因此，現(xiàn)有的抗VEGF單克隆抗體還存在種類少、選擇性不強、親和力較低以及價格昂貴等缺陷。因此研發(fā)新型抗VEGF單克隆抗體，使其具有更低的毒副作用，更佳的臨床藥效，并且能夠降低成本，在價格上能夠被癌癥患者所承受，已成為亟待解決的問題。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供了一種新的抗VEGF單克隆抗體，其具有良好的生物學活性，對VEGF蛋白具有良好的親和力，具有良好的配體-受體結合抑制能力和細胞增殖抑制能力，在低濃度時，其細胞增殖抑制能力優(yōu)于對照抗體bevacizumab。本專利技術提供的新的抗VEGF單克隆抗體能夠用于制備抗腫瘤、抗感染性疾病、抗自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等藥物，從而完成了本專利技術。因此，本專利技術的第一個目的在于提供一種抗VEGF單克隆抗體的氨基酸序列。本專利技術的第二個目的在于提供編碼所述抗VEGF單克隆抗體的核苷酸分子。本專利技術的第三個目的在于提供包含所述核苷酸分子的表達載體。本專利技術的第四個目的在于提供包含所述表達載體的宿主細胞。本專利技術的第五個目的在于提供一種所述抗VEGF單克隆抗體的制備方法。本專利技術的第六個目的在于提供包含所述抗VEGF單克隆抗體的組合物。本專利技術的第七個目的在于提供所述抗VEGF的單克隆抗體在制備VEGF分子阻滯藥物中的用途。為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術采取了如下技術方案：本專利技術采取的技術方案之一為：一種抗VEGF的單克隆抗體，該單克隆抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:8所示。本專利技術所述抗VEGF的單克隆抗體為常規(guī)的單克隆抗體，其包括兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈，其中包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。較佳的，本專利技術所述抗VEGF的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示，其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:8所示。更佳地，該單克隆抗體的重鏈可變區(qū)還包括CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6所示。更佳地，該單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)還包括CDR1’、CDR2’和CDR3’區(qū)，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12所示。更佳地，所述抗VEGF單克隆抗體為人源的。所述抗VEGF單克隆抗體可以是抗體的全長序列，也可以是抗VEGF人源抗體的片段，所述片段為Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv等。優(yōu)選的，所述抗VEGF人源抗體是人源的。更優(yōu)選的，所述抗VEGF人源抗體為IgG1、IgG2或IgG4型抗體。本專利技術進一步提本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
1.一種抗VEGF的單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:8所示。

【技術特征摘要】
1.一種抗VEGF的單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:8所示。2.如權利要求1所述抗VEGF的單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體的重鏈可變區(qū)還包括CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6所示。3.如權利要求1所述抗VEGF的單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)還包括CDR1’、CDR2’和CDR3’區(qū)，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12所示。4.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，編碼權利要求1所述單克隆抗體重鏈的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，編碼其輕鏈的核苷酸序列如SEQIDN...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：何虹霖，姜偉東，
申請(專利權)人：上海復宏漢霖生物技術股份有限公司，上海復宏漢霖生物制藥有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海,31