抗人PLGF單克隆抗體的制備方法技術

本發明專利技術公開了抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，包括動物免疫及脾細胞制備、骨髓瘤細胞的制備、飼養細胞的制備、細胞融合、細胞篩選、亞克隆、抗體純化、染色體分析等步驟；本發明專利技術通過將試驗過程、試驗材料進行優化，使其最適于PLGF單克隆抗體的制備，所制備的PLGF單克隆抗體具有效價高、親和力好，與PLGF抗原結合力強等優點，可用于免疫組化、免疫熒光、放射自顯影或其他方法來定性定位或定量檢測各種疾病如腫瘤或炎癥患者的組織器官中的PLGF表達水平，以輔助臨床診斷，同時PLGF單克隆抗體可作為PLGF蛋白的拮抗劑藥物成分，用于治療因血管過度增生而引起的多種疾病包括各種惡性腫瘤。

Preparation of monoclonal antibodies against human PLGF

The invention discloses a preparation method of monoclonal antibodies against human PLGF, including animal immunity and preparation of spleen cells, preparation of myeloma cells, preparation of feeder cells, cell fusion, cell screening, subcloning, antibody purification, chromosome analysis, etc. The prepared PLGF monoclonal antibody has the advantages of high titer, good affinity and strong binding with PLGF antigen. It can be used for qualitative localization or quantitative detection of PLGF expression in tissues and organs of patients with various diseases such as tumors or inflammation by immunohistochemistry, immunofluorescence, autoradiography or other methods to assist clinical diagnosis. At the same time, PLGF monoclonal antibody can be used as an antagonist to PLGF protein. Pharmaceutical ingredients are used to treat various diseases, including malignant tumors, caused by vascular hyperplasia.

【技術實現步驟摘要】
抗人PLGF單克隆抗體的制備方法
本專利技術涉及細胞工程
，具體涉及抗人PLGF單克隆抗體的制備方法。
技術介紹
血管新生或增生(angiogenesis)在生物學上是指體內的已存在的血管(如毛細血管和小靜脈)通過出芽或分裂的方式而產生新的血管的過程。VEGF是目前已知的最強烈的刺激血管內皮細胞分裂增生的因子。VEGF一般常由血管內皮細胞、巨噬細胞和腫瘤細胞所合成，并通過自分泌/旁分泌方式特異地作用于血管內皮細胞上的受體，而發揮促進血管內皮細胞生長、增殖、遷移、形成等作用。研究表明，在多數惡性腫瘤患者的癌組織中也能夠檢測到VEGF，且VEGF的表達水平增高與腫瘤惡性程度和疾病進展有關此外，VEGF在炎癥病理的血管中起著重要的作用。PLGF與VEGF兩者同源，結構與生物活性相近，且都可與VEGFR1受體結合。但以往的研究更為關注的是VEGF，而對于PLGF，盡管其編碼基因早在1991年就已克隆出，但其在血管增生中的意義長時期以來一直是處于從屬或未定狀態。近年來隨著研究的深入，越來越多的結果證明PLGF實際上參與許多生理或病理條件下的血管增生。因此，需進一步研發出一種PLGF蛋白的單克隆抗體，可用于能夠快速、準確檢測人PLGF的免疫檢測試劑盒。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，制備的抗體特異性好，親和力高，能夠用于PLGF免疫熒光檢測試劑盒，對人體內PLGF蛋白做出快速、準確的檢測。為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：(1)動物免疫及脾細胞制備：采用BALB/c小鼠，將PLGF蛋白與弗氏完全佐劑等體積混勻成油包水的乳劑，皮下多點注射小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點注射小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白尾靜脈注射，3天后，小鼠眼球采血，用ELISA檢測法檢測血清中抗體效價，取效價高的小鼠免疫脾細胞；(2)骨髓瘤細胞的制備：骨髓瘤細胞融合前1天，進行細胞換液并使骨髓瘤細胞在融合當天為對數生長階段；(3)飼養細胞的制備：細胞融合前4天，在無菌的條件下，取小鼠腹腔細胞，即飼養細胞，用5mlHAT培養基將飼養細胞懸浮，調整飼養細胞濃度為2*105個/mL，將飼養細胞懸液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培養箱中培養備用；(4)細胞融合：將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞以10:1的比例混合，加入50％聚乙二醇PEG4000，待融合完畢，將融合細胞懸液加入已鋪有飼養細胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培養箱中培養，融合后第7天每孔用HAT完全培養液半換液，融合后第14天用HT完全培養基半換液，融合后第21天用RPMI-1640完全培養液換液；(5)細胞篩選：細胞長至孔底1/10面積時，酶聯免疫吸附試驗篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細胞，選擇OD值高的雜交瘤細胞進行亞克隆；(6)亞克隆：采用軟瓊脂法進行雜交瘤細胞的亞克隆，陽性孔繼續進行2-3次克隆化，直至100％雜交瘤細胞陽性率，最終得到高特異性PLGF雜交瘤細胞株，將高特異性PLGF雜交瘤細胞株液氮保存；(7)抗體純化：將上述高特異性PLGF雜交瘤細胞株經過濾離心處理后，再通過protein-A親合層析柱分離純化PLGF單克隆抗體，純化后，經SDS-PAGE測定PLGF單克隆抗體純度大于93％。本專利技術具有有益效果：本專利技術制備PLGF單克隆抗體的方法通過將試驗過程、試驗材料進行優化，使其適合于PLGF單克隆抗體的制備，本專利技術所制備的PLGF單克隆抗體具有效價高、親和力好，與PLGF抗原結合力強等優點，可用于免疫組化、免疫熒光、放射自顯影或其他方法來定性定位或定量檢測各種疾病如腫瘤或炎癥患者的組織器官中的PLGF表達水平，以輔助臨床診斷，同時PLGF單克隆抗體可作為PLGF蛋白的拮抗劑藥物成分，用于治療因血管過度增生而引起的多種疾病包括各種惡性腫瘤，例如人乳腺癌，結腸癌和橫紋肌瘤等。具體實施方式下面將結合本專利技術實施例對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例1抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：(1)動物免疫及脾細胞制備：采用BALB/c小鼠，將PLGF蛋白與弗氏完全佐劑等體積混勻成油包水的乳劑，皮下多點注射小鼠，小鼠的接種劑量為100ug/只，接種4只小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點注射小鼠，小鼠的接種劑量為100ug/只，間隔3周進行抗原沖擊，100ugPLGF蛋白不加佐劑尾靜脈注射，3天后，小鼠眼球采血，分離血清，用ELISA檢測法檢測血清中抗PLGF抗體的效價，處死效價高的小鼠，無菌條件下取免疫脾細胞，將免疫脾細胞重懸于不完全RPMI1640培養液中；最后一次免疫多采用尾靜脈注射，可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分；(2)骨髓瘤細胞的制備：骨髓瘤細胞在含10％(v/v)胎牛血清的完全RPMI1640培養液中進行培養，融合前1天，進行細胞換液并使細胞在融合當天為對數生長階段；(3)飼養細胞的制備：細胞融合前4天，通過頸脫位處死未免疫的8周齡KM雌性小鼠，75％酒精浸泡5min后，在無菌的條件下，用消毒剪掀起腹部皮膚，暴露腹膜，75％酒精棉擦拭腹膜，注射器注射10ml不完全培養基至腹腔，針頭留置在腹腔內，另一只手持75％酒精棉輕輕按摩腹部1min后，注射器吸出注入的培養液，2000r/min離心5min,棄上清，用5mlHAT培養基將沉淀飼養細胞懸浮，調整飼養細胞濃度為2*105個/mL，將上述飼養細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％CO2培養箱中培養備用；細胞融合后選擇性培養過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，飼養細胞有助于雜交瘤細胞的繁殖，同時飼養細胞吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用；(4)細胞融合：將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞以10:1的比例混合，放入融合管中，2000r/min離心5min,棄上清，用手指輕彈管底，使沉淀松散成糊狀；50％聚乙二醇PEG40001mL，左手勻速轉動融合管，右手持1mL移液管吸取50％PEG溶液1mL，沿轉動的管壁滴入，60s內加完，在5min內加入25mLDMEM培養基，終止反應，加入速度為：第lmin內加1mL，第2min內加4mL，剩余20mL在5min內加完，1000rpm/min離心10min，棄上清，加入20mLHAT培養基，輕輕吹打使沉淀細胞懸浮；將細胞懸液加入已鋪有飼養細胞的96孔板中，加入量為0.1mL/孔，置37℃、含5％CO2的培養箱中培養，融合后第7天每孔用HAT完全培養液半換液，融合后第14天用HT完全培養基半換液，融合后第21天用RPMI-1640完全培養液換液；(5)細胞篩選：細胞長至孔底1/10面積時，用碳酸鹽緩沖液(0.1M，pH9.6)將PLGF蛋白稀釋為5ug/ml，以100ul/孔量加入酶標板孔中，4℃過夜，棄去孔內液體，磷酸鹽緩沖液清洗2次，每孔加200ul封閉液4℃過夜，封閉液為含2％BSA的磷酸鹽緩沖液，經含0.1％Tween20的磷酸鹽緩沖液洗滌后，加入待檢雜交瘤細胞培養上清，以未融合的骨髓瘤細胞培養上清為陰性對照，以免疫小鼠血清為陽性對照，3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)動物免疫及脾細胞制備：采用BALB/c小鼠，將PLGF蛋白與弗氏完全佐劑等體積混勻成油包水的乳劑，皮下多點注射小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點注射小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白尾靜脈注射，3天后，小鼠眼球采血，用ELISA檢測法檢測血清中抗體效價，取效價高的小鼠免疫脾細胞；(2)骨髓瘤細胞的制備：骨髓瘤細胞融合前1天，進行細胞換液并使骨髓瘤細胞在融合當天為對數生長階段；(3)飼養細胞的制備：細胞融合前4天，在無菌的條件下，取小鼠腹腔細胞，即飼養細胞，用5ml?HAT培養基將飼養細胞懸浮，調整飼養細胞濃度為2*105個/mL，將飼養細胞懸液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培養箱中培養備用；(4)細胞融合：將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞以10:1的比例混合，加入50％聚乙二醇PEG4000，待融合完畢，將融合細胞懸液加入已鋪有飼養細胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培養箱中培養，融合后第7天每孔用HAT完全培養液半換液，融合后第14天用HT完全培養基半換液，融合后第21天用RPMI?1640完全培養液換液；(5)細胞篩選：細胞長至孔底1/10面積時，酶聯免疫吸附試驗篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細胞，選擇OD值高的雜交瘤細胞進行亞克隆；(6)亞克隆：采用軟瓊脂法進行雜交瘤細胞的亞克隆，陽性孔繼續進行2?3次克隆化，直至100％雜交瘤細胞陽性率，最終得到高特異性PLGF雜交瘤細胞株，將高特異性PLGF雜交瘤細胞株液氮保存；(7)抗體純化：將上述高特異性PLGF雜交瘤細胞經過濾離心處理后，再通過protein?A親合層析柱分離純化PLGF單克隆抗體，純化后，經SDS?PAGE測定PLGF單克隆抗體純度大于93％。...

【技術特征摘要】
1.抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)動物免疫及脾細胞制備：采用BALB/c小鼠，將PLGF蛋白與弗氏完全佐劑等體積混勻成油包水的乳劑，皮下多點注射小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點注射小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白尾靜脈注射，3天后，小鼠眼球采血，用ELISA檢測法檢測血清中抗體效價，取效價高的小鼠免疫脾細胞；(2)骨髓瘤細胞的制備：骨髓瘤細胞融合前1天，進行細胞換液并使骨髓瘤細胞在融合當天為對數生長階段；(3)飼養細胞的制備：細胞融合前4天，在無菌的條件下，取小鼠腹腔細胞，即飼養細胞，用5mlHAT培養基將飼養細胞懸浮，調整飼養細胞濃度為2*105個/mL，將飼養細胞懸液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培養箱中培養備用；(4)細胞融合：將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞以10:1的比例混合，加入50％聚乙二醇PEG4000，待融合完畢，將融合細胞懸液加入已鋪有飼養細胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培養箱中培養，融合后第7天每孔用HAT完全培養液半換液，融合后第14天用HT完全培養基半換液，融合后第21天用RPMI-1640完全培養液換液；(5)細胞篩選：細胞長至孔底1/10面積時，酶聯免疫吸附試驗篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細胞，選擇OD值高的雜交瘤細胞進行亞克隆；(6)亞克隆：采用軟瓊脂法進行雜交瘤細胞的亞克隆，陽性孔繼續進行2-3次克隆化，直至100％雜交瘤細胞陽性率，最終得到高特異性PLGF雜交瘤細胞株，將高特異性PLGF雜交瘤細胞株液氮保存；(7)抗體純化：將上述高特異性PLGF雜交瘤細胞經過濾離...

【專利技術屬性】
技術研發人員：唐靜，張偉，催叢叢，
申請(專利權)人：寧波奧丞生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江,33