一種抗體純化方法技術

本發明專利技術實施例提供了一種抗體純化方法，用M1重組蛋白免疫的動物，對重組蛋白質反應度優于天然蛋白質，能夠產生性能穩定、抗原效價高的單抗，采用CA?AS法進行抗體純化，抗體回收率、抗體活性、抗體純度等方面存在較大優勢，且此法操作簡便，可重復使用，生產成本較低。

A Purification Method of Antibody

The embodiment of the present invention provides an antibody purification method. Animals immunized with M1 recombinant protein have better reactivity to the recombinant protein than natural protein, and can produce monoclonal antibodies with stable performance and high antigen titer. The CA_AS method has great advantages in antibody purification, such as antibody recovery rate, antibody activity and antibody purity, and the method is simple to operate and can be reused. The production cost is low.

【技術實現步驟摘要】
一種抗體純化方法
本專利技術實施例涉及生物制藥
，更具體地，涉及一種抗體純化方法。
技術介紹
當代抗體藥物的工藝研發是基于基因工程、細胞工程和發酵工程基礎之上的，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞作為主要的哺乳動物細胞表達宿主細胞具有遺傳背景清晰、具備翻譯后加工能力等特點，成為了蛋白質生產的標準工業化細胞株，同樣也適合于抗體蛋白的表達。隨著細胞懸浮培養技術的發展，使得大規模培養成為可能，而無血清培養基的應用則使得蛋白純化工藝更為簡便，這一切都大大加速了抗體藥物的產業化進程，為制備價廉質優的抗體藥物奠定了基礎。自首個單克隆抗體制備以來，在Koehler和Milstein的基礎上經過近30年的蓬勃發展，單克隆抗體制備技術在生命科學研究以及醫學實踐方面做出了巨大的貢獻，已成為了現代生物技術支柱產業之一。單克隆抗體藥物因其靶向特異性，毒副作用低，治療的高效性等明顯優勢在腫瘤自身免疫疾病、器官移植排斥及病毒感染等領域有重要的應用。抗體藥物制造工藝從研發時期的細胞株構建、培養基優化、上游細胞培養、下游純化到最后制劑這五個方面的任何一個環節都對抗體藥物有很重要的影響，其中又以下游純化工藝最為復雜繁瑣，下游工藝含有多個步驟，目前常用的的是親和層析、離子層析和疏水層析串聯使用的方法。雖然目前都采用這種模式，但是每個工藝中細小參數的變化都有可能導致巨大的變異。下游層析工藝中除了要除去HCP、殘留DNA和二聚體多聚體等雜質之外還要對上游可能引入的病毒進行去除。抗體藥物生產過程中，親和層析通常用于抗體的捕獲階段，即第一個純化工藝步驟，從發酵料液中選擇性分離出所需抗體，接著用離子交換層析和/或疏水層析和/或混合模式層析，來進一步精純親和層析洗脫下來的抗體。就一般工藝而言，親和層析洗脫得到的樣品通常會進行低pH病毒孵育，并且進行下一步層析前都會對低pH孵育的樣品進行處理，以達到不同層析方法需要的操作條件。傳統的陰離子層析前樣品的處理，一般都是一步調pH，即直接將低pH孵育的樣品回調到陰離子層析上樣所需的pH范圍。但是該方法可能會導致抗體不穩定，生成沉淀從而造成樣品的損失，另外對抗體的雜質去除效果不理想，增加陰離子層析吸附雜質的量，對層析填料造成傷害，縮短其壽命。陰離子交換層析主要是去除細菌內毒素、宿主蛋白和DNA雜質等，常規的方法是采用流穿(flow-through)方式，抗體直接通過柱子，而污染物被吸收抗體藥物中雜質的存在會導致藥效降低，嚴重的會導致人體死亡。例如：含有內毒素或被內毒素污染的藥物進入人體后會引起多種變態反應，如：高燒、休克、甚至死亡。許多抗體，包括IgG和IgM，均會形成聚集物，聚集物的存在會產生和主產品不同的藥效，會造成抗藥性抗體的形成。殘留的宿主細胞蛋白有可能刺激機體發生免疫應答產生相應的抗體，同樣會對人體造成傷害。
技術實現思路
本專利技術實施例提供了一種克服上述問題或者至少部分地解決上述問題的一種抗體純化方法。本專利技術實施例提供了一種抗體純化方法，包括：步驟一、在M1基因SEQNO.2中插入表達載體pet32a，得到M1重組蛋白，以所述M1重組蛋白為抗原，免疫動物，再進行細胞融合和亞克隆；將上述亞克隆后的細胞擴大培養并注射至小鼠腹腔，7-10日后抽取小鼠體內的腹水，將腹水在–20℃下保存；步驟二、將腹水置于4℃解凍過夜，取出后4℃條件下，10000×g離心10min，取上清，4℃保存；取腹水，用0.06mol/LpH4.4醋酸緩沖液稀釋3倍，用1mol/LHCl調節pH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11μl辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30min內加完，4℃靜置2h；取出后，4℃條件下，15000×g離心30min，取上清，加入1/10體積的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH調pH至7.2，在冰面操作加入飽和硫酸銨至45％飽和度，靜置30min；取出后，10000×g離心30min，棄上清，將沉淀4℃保存；步驟三、將步驟二中的沉淀淀以0.01mol/LpH7.2PB溶液A重溶，經SepharoseG-25除鹽后，過DEAE陰離子層析柱；以含0.5mol/LNaCl的0.01mol/LpH7.2PB為洗脫液B，A、B液混合進行線性梯度洗脫，收集蛋白峰；提純樣品保存于–20℃環境中。進一步的，還包括：步驟四、采用間接ELISA法檢測純化后抗體效價。進一步的，在步驟一中，免疫動物在初次免疫后至少加強注射3次。進一步的，所述載體pet32a為SEQNO.3。進一步的，在步驟一中，細胞融合后還包括：吸取細胞上清100ul/孔進行間接ELISA檢測；根據ELISA結果，判斷陽性孔；用單道移液器挑檢整板檢測出的陽性孔，進行第二次復檢，進一步確認陽性孔。進一步的，在步驟一種，亞克隆方法包括：對復篩的陽性孔細胞做兩輪亞克隆，第一次亞克隆有限稀釋陽性孔中細胞，至多個孔中，加HTDMEM培養基培養，7天后在顯微鏡下觀察，間接ELISA檢測有克隆生長的孔，取OD值高的孔為陽性孔；挑取陽性孔的細胞進行第二次亞克隆，獲取陽性細胞株作為最終制備的單抗細胞，并擴大培養。本專利技術實施例提供的一種抗體純化方法，用M1重組蛋白免疫的動物，對重組蛋白質反應度優于天然蛋白質，能夠產生性能穩定、抗原效價高的單抗，采用CA-AS法進行抗體純化，抗體回收率、抗體活性、抗體純度等方面存在較大優勢，且此法操作簡便，可重復使用，生產成本較低。具體實施方式為使本專利技術實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本專利技術實施例，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚地描述，顯然，所描述的實施例是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。流感病毒是一種重要的季節性傳染性疾病，歷史上的幾次大爆發給人類健康和經濟造成了巨大的危害和損失。自流感病毒被發現以來，人們就致力于流感病毒的診斷和防控。甲型流感病毒具有高度變異、亞型眾多等特點，給其防控帶來一定的困難。快速、準確診斷流感可以為正確治療和防控流感提供時間。準確診斷流感病毒是否感染的的膠體金試紙條，以及檢測A型流病毒的抗原ELISA試劑盒，都離不開性能穩定、抗原效價高的流感單抗，國內生物制藥公司，就是因為沒有好的單抗，所以不能生產好用的流感病毒診斷試劑。M1由252個氨基酸殘基組成，分子量約26KDa,它是病毒的主要結構蛋白，占流感病毒蛋白總量的30％～40％。該蛋白具有型特異性，其抗原性差異是流感病毒分型的依據之一；單克隆抗體被廣泛應用于免疫學、藥理學、細胞生物學、微生物學、臨床疾病的預防、診斷和治療及畜牧產品違禁限制藥物的檢測等。其生產方式主要有小鼠體內誘生腹水和雜交瘤細胞體外培養；前者生產成本低，是目前用于體外應用的主要生產方式。但無論哪種方式生產的單抗，均含有大量的雜蛋白，主要包括白蛋白、轉鐵蛋白、血清白蛋白、α-巨球蛋白、脂類蛋白以及其他宿主蛋白等，不能直接應用于體外。因此需對單抗進行后續的純化，以達到使用要求。但目前尚沒有一種方法能滿足不同目的需要，尤其是在規模化制備單克隆抗體問題上顯得更為突出。針對現有技術中的上述缺陷，本專利技術實施例提供了一種抗體純化方法，包括：步驟一、在M1基因S本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種抗體純化方法，其特征在于，包括：步驟一、在M1基因SEQ?NO.2中插入表達載體pet32a，得到M1重組蛋白，以所述M1重組蛋白為抗原，免疫動物，再進行細胞融合和亞克隆；將上述亞克隆后的細胞擴大培養并注射至小鼠腹腔，7?10日后抽取小鼠體內的腹水，將腹水在–20℃下保存；步驟二、將腹水置于4℃解凍過夜，取出后4℃條件下，10000×g離心10min，取上清，4℃保存；取腹水，用0.06mol/LpH4.4醋酸緩沖液稀釋3倍，用1mol/L?HCl調節pH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11μl辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30min內加完，4℃靜置2h；取出后，4℃條件下，15000×g離心30min，取上清，加入1/10體積的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH調pH至7.2，在冰面操作加入飽和硫酸銨至45％飽和度，靜置30min；取出后，10000×g離心30min，棄上清，將沉淀4℃保存；步驟三、將步驟二中的沉淀淀以0.01mol/L?pH?7.2PB溶液A重溶，經Sepharose?G?25除鹽后，過DEAE陰離子層析柱；以含0.5mol/L?NaCl的0.01mol/L?pH?7.2PB為洗脫液B，A、B液混合進行線性梯度洗脫，收集蛋白峰；提純樣品保存于–20℃環境中。...

【技術特征摘要】
1.一種抗體純化方法，其特征在于，包括：步驟一、在M1基因SEQNO.2中插入表達載體pet32a，得到M1重組蛋白，以所述M1重組蛋白為抗原，免疫動物，再進行細胞融合和亞克隆；將上述亞克隆后的細胞擴大培養并注射至小鼠腹腔，7-10日后抽取小鼠體內的腹水，將腹水在–20℃下保存；步驟二、將腹水置于4℃解凍過夜，取出后4℃條件下，10000×g離心10min，取上清，4℃保存；取腹水，用0.06mol/LpH4.4醋酸緩沖液稀釋3倍，用1mol/LHCl調節pH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11μl辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30min內加完，4℃靜置2h；取出后，4℃條件下，15000×g離心30min，取上清，加入1/10體積的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH調pH至7.2，在冰面操作加入飽和硫酸銨至45％飽和度，靜置30min；取出后，10000×g離心30min，棄上清，將沉淀4℃保存；步驟三、將步驟二中的沉淀淀以0.01mol/LpH7.2PB溶液A重溶，經SepharoseG-25除鹽后，過DEAE陰離子層析柱；以含0.5mol/LNaCl...

【專利技術屬性】
技術研發人員：冷毅斌，王長樂，
申請(專利權)人：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：湖北,42