溶瘤腫瘤病毒及使用方法技術

本文描述在E2F失調腫瘤細胞中選擇性地復制的重組腺病毒。所述重組腺病毒具有編碼經修飾的E1?A蛋白、經修飾或缺失的E4orf?1蛋白、經修飾或缺失的E4orf6/7蛋白或其任意組合的基因組，以使所述重組腺病毒在正常細胞中與在腫瘤細胞中相比展現復制缺陷。在一些情況下，所述重組腺病毒基因組編碼將所述重組腺病毒靶向特定的細胞類型、使所述病毒自肝臟去靶向、抑制肝臟中的病毒復制和/或逃避已有的中和抗體的其他修飾。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】溶瘤腫瘤病毒及使用方法相關申請的交叉引用本申請要求于2014年9月24日提交的美國臨時申請No.62/054,724的權益，所述臨時申請以引用的方式全文納入本文。
本公開內容涉及在腫瘤細胞中選擇性地經歷溶解性復制的重組腺病毒，其在E1A、E4orf1和/或E4orf6/7中包含一種或多種修飾。所述重組腺病毒任選地在纖維、六鄰體(hexon)或衣殼蛋白中具有一種或多種修飾以使得可全身遞送且在腫瘤細胞中吸收。政府支持認可本專利技術在由美國國立衛生研究院(theNationalInstitutesofHealth)頒予的授權號為5T32GM007240-35的政府支持下完成。政府對本專利技術享有某些權利。
技術介紹
癌癥是一種復雜的衰竭性疾病，每年造成五十多萬人死亡。深切需要針對癌癥的更有效、更具選擇性且更安全的治療。對于這種普遍的、威脅生命的疾病的現有治療，如化療和手術，極少消除所有惡性細胞，而且常展示出可能超出治療益處的有害副作用。有潛力解決目前癌癥治療的多種不足的一種方法是溶瘤腺病毒療法(Pesonen等人,MolecularPharmaceutics8(1):12-28,2010)。腺病毒(Ad)是一種自我復制型生物機構。它由包裝在蛋白質外殼內的線性雙鏈36kbDNA基因組組成。腺病毒侵入并劫持細胞復制機構去復制，經組裝后，誘導溶解性細胞死亡以擴散到周圍細胞。在癌癥中通過突變來靶向這些極為相同的細胞控制。可采用這種認知以產生如導彈般發揮作用的合成性病毒，尤其在腫瘤細胞中感染和復制，以及溶解細胞從而釋放可搜尋出且破壞遠端轉移性腫瘤的數千個病毒后代，同時克服可能的抗性。因此，溶瘤病毒設計的目標在于產生在癌細胞中特異性復制，而使正常細胞不受損害的病毒。然而，重要的挑戰在于設計出可以選擇性地在癌細胞中復制的病毒。因此，仍需要選擇性地在癌細胞中復制的其他病毒。專利技術簡述公開了選擇性地在E2F失調的腫瘤細胞中復制的重組腺病毒。所述重組腺病毒具有編碼經修飾的E1A蛋白、經修飾或缺失的E4orf1蛋白、經修飾或缺失的E4orf6/7蛋白或其任意組合的基因組，以使所述重組腺病毒在正常細胞中與在腫瘤細胞中相比展現復制缺陷。重組腺病毒的基因組任選地進一步編碼將重組腺病毒靶向特定的細胞類型、使病毒自肝臟去靶向(detarget)、抑制肝臟中的病毒復制和/或逃避已有的中和抗體的其他修飾。本文提供一種重組腺病毒，其中所述重組腺病毒的基因組編碼經修飾的E1A蛋白、經修飾或缺失的E4orf1蛋白、經修飾或缺失的E4orf6/7蛋白或其任意組合，且其中所述重組腺病毒在正常細胞中與在腫瘤細胞中相比展現復制缺陷。在一些實施方案中，所述重組腺病毒基因組進一步編碼用于誘導型再靶向的修飾。例如，所述基因組任選地編碼與FK506結合蛋白(FKBP)融合的靶向配體和與野生型FKBP-雷帕霉素結合(FKBP-rapamycinbinding，FRB)蛋白或包含T2098L置換的突變體FRB蛋白融合的腺病毒纖維蛋白。在一些實施方案中，所述重組腺病毒基因組進一步編碼使腺病毒自肝臟去靶向的修飾。在一些實例中，所述基因組編碼六鄰體蛋白的修飾和/或包括一個或多個肝特異性微RNA的結合位點。在一些實施方案中，所述重組腺病毒基因組編碼嵌合纖維蛋白以將病毒重新導向至替代的細胞受體。在一些實施方案中，所述重組腺病毒基因組編碼衣殼交換腺病毒(capsid-swappedadenovirus)以逃避(evade)已有的中和抗體。在一些實例中，基因組的E1、E3和E4區域源自第一腺病毒血清型且基因組的E2B、L1、L2、L3、E2A和L4區域源自第二腺病毒血清型。進一步提供重組報告腺病毒基因表達載體，其中所述重組腺病毒的基因組包含E1的缺失且編碼EF1α啟動子驅動的GFP-熒光素酶融合蛋白。在一些實施方案中，所述腺病毒表達載體進一步包括在3′-UTR中的肝特異性微RNA結合位點。本文還提供包含所公開的重組腺病毒的組合物。另外，提供包含重組腺病毒基因組序列的重組核酸分子和載體。本公開內容進一步提供通過施用本文公開的重組腺病毒(或其組合物)來抑制腫瘤細胞活力、抑制腫瘤發展、減小腫瘤體積和治療患有癌癥的對象的方法。由參照附圖進行的以下詳細描述，本公開內容的上述和其他目標和特征將會變得更加清楚。附圖簡述圖1A-1B是細胞裂解物的免疫印跡，其示出了來自重組腺病毒感染細胞的腺病毒E1A的表達。細胞受空白感染或受AdSyn-CO102(野生型)、AdSyn-CO181(E1AΔLXCXE/ΔE4orf6/7)、AdSyn-CO189(E1AΔLXCXE)或ONYX-838(E1AΔCR2)感染。對于圖1A，以MOI10感染靜止(quiescent)人類原代小氣道上皮細胞(SAEC)且針對E1A表達分析裂解物。在受AdSyn-CO102感染的細胞中，E1A水平在感染后期下降。類似地，在受AdSyn-CO189或ONYX-838感染的細胞中，E1A水平在感染后期下降；然而，在較早的時間點，E1A表達大于AdSyn-CO102-感染細胞中的E1A表達。相反，受AdSyn-CO181感染的細胞在整個感染期間展現出更強且持續的E1A表達，這表示無法在整個腺病毒生命周期中進展。對于圖1B，以MOI30感染鋪滿的肺腺癌細胞(A549)且針對E1A表達分析裂解物。所有感染都導致E1A水平在感染后期下降，這表示典型的腺病毒生命周期發展。圖2A-2B是細胞裂解物的免疫印跡，其示出了受感染的原代和腫瘤細胞中的細胞周期蛋白和腺病毒晚期蛋白的表達。細胞受空白感染或受AdSyn-CO102(野生型)、AdSyn-CO181(E1AΔLXCXE/ΔE4orf6/7)、AdSyn-CO189(E1AΔLXCXE)、AdSyn-CO210(ΔE4orf6/7)或ONYX-838(E1AΔCR2)感染。對于圖2A，以MOI10感染SAEC。與野生型病毒和僅具有E1A突變的病毒相比，AdSyn-CO181無法活化E2F依賴性細胞周期靶蛋白、S期細胞周期蛋白、細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白B。此外，具有E4orf6/7突變的AdSyn-CO181和AdSyn-CO210在晚期蛋白表達和復制方面存在缺陷。相對AdSyn-CO210而言，這兩種缺陷的明顯程度較小。對于圖2B，以MOI30感染A549細胞。與受感染的原代細胞相比，晚期結構蛋白的表達無明顯缺陷，且細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白B仍存在于所有受感染的A549樣本中。圖3A-3B是分別定量受感染的SAEC和A549細胞中的細胞DNA的FACS直方圖。細胞受空白感染或受AdSyn-CO102(野生型)、AdSyn-CO181(E1AΔLXCXE/ΔE4orf6/7)、AdSyn-CO189(E1AΔLXCXE)或AdSyn-CO210(ΔE4orf6/7)感染，且在感染后48小時收集。未受感染細胞的DNA含量顯示在背景譜(profile)中。Y軸是細胞的相對豐度，且X軸是細胞中來自碘化丙啶(PI)的熒光，其與DNA的量成正比。對于圖3A而言，以MOI10感染靜止SAEC。AdSyn-CO181感染相對于AdSyn-CO102展示在SAEC中強烈的DNA復制缺陷，這與病本文檔來自技高網...

【技術保護點】
重組腺病毒，其中所述重組腺病毒的基因組編碼經修飾的E1A蛋白、經修飾或缺失的E4orf1蛋白、經修飾或缺失的E4orf6/7蛋白，或其任意組合，且其中所述重組腺病毒在正常細胞中與在腫瘤細胞中相比展現復制缺陷。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.09.24 US 62/054,7241.重組腺病毒，其中所述重組腺病毒的基因組編碼經修飾的E1A蛋白、經修飾或缺失的E4orf1蛋白、經修飾或缺失的E4orf6/7蛋白，或其任意組合，且其中所述重組腺病毒在正常細胞中與在腫瘤細胞中相比展現復制缺陷。2.權利要求1的重組腺病毒，其中所述基因組編碼經修飾的E1A蛋白和經修飾或缺失的E4orf1蛋白。3.權利要求1的重組腺病毒，其中所述基因組編碼經修飾的E1A蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白。4.權利要求1的重組腺病毒，其中所述基因組編碼經修飾的E1A蛋白、經修飾或缺失的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白。5.權利要求1至4中任一項的重組腺病毒，其中所述經修飾的E1A蛋白包含：LXCXE基序缺失；殘基2-11缺失；C124G置換；Y47H置換；Y47H置換和C124G置換；或Y47H置換、C124G置換和殘基2-11缺失。6.權利要求1、2、4和5中任一項的重組腺病毒，其中所述經修飾的E4orf1蛋白包含PDZ-結合基序缺失。7.權利要求1的重組腺病毒，其中所述基因組編碼：包含所述LXCXE基序缺失的經修飾的E1A蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含所述LXCXE基序缺失的經修飾的E1A蛋白、包含所述PDZ-結合基序缺失的經修飾的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含所述LXCXE基序缺失的經修飾的E1A蛋白、缺失的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含C124G置換的經修飾的E1A蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含C124G置換的經修飾的E1A蛋白、包含所述PDZ-結合基序缺失的經修飾的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含C124G置換的經修飾的E1A蛋白、缺失的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含殘基2-11缺失的經修飾的E1A蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含殘基2-11缺失的經修飾的E1A蛋白、包含所述PDZ-結合基序缺失的經修飾的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含殘基2-11的經修飾的E1A蛋白、缺失的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含Y47H置換和C124G置換的經修飾的E1A蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含Y47H置換和C124G置換的經修飾的E1A蛋白、包含所述PDZ-結合基序缺失的經修飾的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含Y47H置換和C124G置換的經修飾的E1A蛋白、缺失的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含Y47H置換、C124G置換和殘基2-11缺失的經修飾的E1A蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；包含Y47H置換、C124G置換和殘基2-11缺失的經修飾的E1A蛋白、包含所述PDZ-結合基序缺失的經修飾的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白；或包含Y47H置換、C124G置換和殘基2-11缺失的經修飾的E1A蛋白、缺失的E4orf1蛋白和缺失的E4orf6/7蛋白。8.權利要求7的重組腺病毒，其中所述基因組包含SEQIDNO:6-8、10-12、14、15、18-20和22-24中任一核苷酸序列。9.權利要求1-7中任一項的重組腺病毒，其中所述基因組進一步編碼與FK506結合蛋白(FKBP)融合的靶向配體以及與野生型FKBP-雷帕霉素結合(FRB)蛋白或包含T2098L置換的突變體FRB蛋白融合的腺病毒纖維蛋白。10.權利要求9的重組腺病毒，其中所述靶向配體是單域抗體。11.權利要求10的重組腺病毒，其中所述單域抗體對EGFR具有特異性。12.權利要求1-7和9-11中任一項的重組腺病毒，其中所述基因組包含E3-RIDα/RIDβ和E3-14.7k編碼序列的缺失。13.權利要求9-12中任一項的重組腺病毒，其中所述基因組包含SEQIDNO:25或SEQIDNO:26的核苷酸序列。14.權利要求1-7和9-12中任一項的重組腺病毒，其中所述基因組進一步編碼經修飾的六鄰體蛋白。15.權利要求14的重組腺病毒，其中所述經修飾的六鄰體蛋白包含E451Q置換。16.權利要求14或權利要求15的重組腺病毒，其中所述基因組包含SEQIDNO:30、SEQIDNO:92或SEQIDNO:97的核苷酸序列。17.權利要求1-7中任一項的重組腺病毒，其中所述基因組進一步編碼與包含T2098L置換的突變體FRB蛋白融合的腺病毒纖維蛋白。18.權利要求17的重組腺病毒，其中所述基因組進一步編碼包含E451Q置換的經修飾的六鄰體蛋白。19.權利要求17或權利要求18的重組腺病毒，其中所述基因組包含SEQIDNO:31的核苷酸序列。20.權利要求1-19中任一項的重組腺病毒，其中所述基因組進一步包含一個或多個肝特異性微RNA的結合位點。21.權利要求20的重組腺病毒，其中所述一個或多個肝特異性微RNA的結合位點位于E1A的3’-UTR中。22.權利要求20或權利要求21的重組腺病毒，其中所述肝特異性微RNA是miR-122。23.權利要求1-22中任一項的重組腺病毒，其中所述基因組編碼嵌合纖維蛋白。24.權利要求23的重組腺病毒，其中所述嵌合纖維蛋白包含來自第一腺病毒血清型的纖維軸和來自第二腺病毒血清型的纖維結節。25.權利要求24的重組腺病毒，其中所述第一腺病毒血清型是Ad5且所述第二腺病毒血清型是Ad3、Ad9、Ad11、Ad12、Ad34或Ad37。26.權利要求25的重組腺病毒，其中所述第一腺病毒血清型是Ad5且所述第...

【專利技術屬性】
技術研發人員：C·奧謝，S·米亞克斯托納，
申請(專利權)人：薩克生物研究學院，
類型：發明
國別省市：美國,US