一種表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒及其應用制造技術

本發明專利技術提供了一種表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒及其應用，利用已建立的新城疫病毒PHY.LMV42株的反向遺傳操作平臺，將新型鴨細小病毒的VP3基因ORF插入NDV全長轉錄載體pLMV?RFP，構建出重組質粒pLMV?NDPV?VP3，該重組質粒與三個輔助質粒共轉染BHK?21細胞后，獲得了具有較高繁殖性能的表達NDPV?VP3蛋白的重組疫苗株rLMV?NDPV?VP3。NDPV?VP3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之間非編碼區，經反向遺傳技術獲得重組病毒rLMV?NDPV?VP3。該表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒可用于新型鴨細小病毒病和鴨新城疫的預防。

Recombinant Newcastle disease virus expressing new VP3 gene of Duck Parvovirus and its application

The invention provides a recombinant Newcastle disease virus expressing the VP3 gene of the New Duck Parvovirus and its application. Using the reverse genetic operation platform of the established Newcastle disease virus PHY.LMV42 strain, the VP3 gene ORF of the New Duck Parvovirus is inserted into the NDV full length transcriptional carrier pLMV RFP, and the recombinant plasmid pLMV NDPV NDPV VP3 is constructed. After CO transfection of the recombinant plasmid and three auxiliary plasmids to BHK 21 cells, the recombinant vaccine strain rLMV NDPV VP3, a recombinant vaccine strain with high reproductive performance, was obtained for the expression of VP3 protein. The NDPV VP3 gene is located in the non coding region between the P gene and M gene of Newcastle disease virus, and the recombinant virus rLMV NDPV NDPV VP3 is obtained by reverse genetics. The recombinant Newcastle disease virus expressing the VP3 gene of New Duck Parvovirus can be used for the prevention of New Duck Parvovirus Disease and duck Newcastle disease.

【技術實現步驟摘要】
一種表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒及其應用
本專利技術涉及反向遺傳學應用領域，具體涉及一種表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒及其應用。
技術介紹
2014年以來，在我國山東、安徽、江蘇等地鴨群中大面積爆發了一種以生長遲緩、鴨(上下)喙變短、舌頭外露下垂、跛行、癱瘓、拉稀以及翅、腿易折斷為主要臨床特征的傳染性疾病，俗稱“鴨短喙-侏儒綜合征”或“鴨大舌病”。經鑒定該病病原為一種新型鴨細小病毒(novelduckparvovirus，NDPV)，與小鵝瘟病毒親源關系較近，但二者不處于同一進化分支。鴨短喙-侏儒綜合征主要發生于10-25日齡肉鴨，發病鴨常因采食和飲水困難而消瘦，甚至死亡，發病率20％-30％，甚至高達50％，給養鴨業造成了巨大的經濟損失。因此，迫切需要開發相關疫苗用于該病的防控。新城疫(NewcastleDisease，ND)是危害養禽業的重要傳染病之一，近年來，新城疫對鴨的危害日趨嚴重。疫苗接種和嚴格的生物安全措施是控制新城疫的主要措施。新城疫病毒在靶器官中定向增殖，分為嗜呼吸道毒株和嗜消化道毒株，嗜呼吸道毒株主要有Mukteswar株、HB1株、F株、LaSota和LaSota克隆株等。嗜消化道毒株主要有V4株、VG/GA株、Ulster2C株和PHY.LMV42株等。一些新城疫弱毒株如LaSota、B1、VG/GA已被廣泛用于新城疫的防控。隨著反向遺傳操作技術的深入發展，新城疫病毒活載體疫苗得到廣泛的研究和應用。重組新城疫病毒作為活載體疫苗具有突出的優點，不僅可以誘導體液免疫和細胞免疫，還可在體內增殖并長期表達抗原基因，且不會與宿主基因組整合，安全性要優于DNA病毒載體。
技術實現思路
本專利技術旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒及其應用，以解決現有技術中缺乏一種NDPV-VP3蛋白制備方法的技術問題。本專利技術要解決的另一技術問題是采用基于重組技術制備NDPV-VP3蛋白時，該蛋白基因在重組載體上的表達效率較低。本專利技術要解決的再一技術問題是現有技術在制備NDPV、NDV二聯疫苗時需要分別制備抗原。為實現以上技術目的，本專利技術采用以下技術方案：一種表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，該重組新城疫病毒是通過以下方法構建的：1)取鴨細小病毒，利用RT-PCR方法擴增得到NDPV-VP3基因，回收PCR產物，連接至pMD18-T-Vector；2)將NDPV-VP3基因與pLMV-RFP線性化載體相連接，并將連接產物轉化至Stbl2感受態細胞，篩選出陽性克隆，即得到重組NDV病毒質粒；3)將表達T7聚合酶的重組痘病毒vTF7-3以MOI＝3的滴度接種于單層BHK-21細胞的24孔板內，孵育1h后，將pLMV-VP3、pcDNA-NP、pcDNA-P及pcDNA-L質粒共轉染BHK-21細胞，轉染72h后，將收獲拯救的重組病毒接種10日齡SPF雞胚，收獲HA、HI檢測均為陽性的雞胚尿囊液，即得到重組新城疫病毒rLMV-NDPV-VP3。作為優選，步驟1)中RT-PCR擴增的引物序列分別如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示。作為優選，步驟2)中所述將NDPV-VP3基因與pLMV-RFP線性化載體相連接，具體包括以下操作：A)以含有PHY.LMV42全長cDNA的重組質粒pLMV-RFP為模板，利用引物在質粒pLMV-RFP的RFPORF的兩端通過反向PCR擴增得到含PHY.LMV42全長cDNA的線性化載體；B)利用引物擴增NDPV-VP3基因，得到的基因末端含有與PHY.LMV42線性化載體末端相相同的15bp擴展序列；經QIAEXIIGelExtractionKit回收后，通過CloningKit將NDPV-VP3基因與PHY.LMV42線性化載體連接。作為優選，步驟A)中所述引物序列分別如SEQIDNo.6、SEQIDNo.7所示。作為優選，步驟B)中所述引物序列分別如SEQIDNo.8、SEQIDNo.9所示。作為優選，VP3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之間非編碼區。作為優選，步驟B)中將連接產物轉化至Stbl2感受態細胞后30℃培養24h，而后通過引物VP3-F、VP3-R進行PCR鑒定，篩選出陽性克隆。作為優選，所述的重組新城疫病毒為PHY.LMV42嗜腸道型毒株。作為優選，所述的VP3基因來源于新型鴨細小病毒山東分離株。同時，本專利技術提供了上述重組新城疫病毒用于制備鴨細小病毒病、鴨新城疫疫苗抗原的應用。本專利技術提供了一種表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒及其應用，該技術方案利用已建立的新城疫病毒PHY.LMV42株的反向遺傳操作平臺，將新型鴨細小病毒的VP3基因ORF插入NDV全長轉錄載體pLMV-RFP，構建出重組質粒pLMV-NDPV-VP3，該重組質粒與三個輔助質粒共轉染BHK-21細胞后，獲得了具有較高繁殖性能的表達NDPV-VP3蛋白的重組疫苗株rLMV-NDPV-VP3。該重組新城疫病毒株為PHY.LMV42株，其為嗜腸道型毒株。NDPV-VP3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之間非編碼區，經反向遺傳技術獲得重組病毒rLMV-NDPV-VP3。本專利技術的表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒可用于新型鴨細小病毒病和鴨新城疫的預防，達到一針防多病的效果。附圖說明圖1是本專利技術具體實施方式中pLMV-RFPPCR線性化電泳圖；其中M為DNAMarkerDL15000、1為pLMV-RFPPCR線性化的結果。圖2是本專利技術具體實施方式中重組病毒的NDPV-VP3基因的RT-PCR電泳圖；其中M為DNAMarkerDL15000、1為重組病毒rLMV-NDPV-VP3的結果。圖3是本專利技術具體實施方式中間接免疫熒光檢測NDPV-VP3蛋白的表達結果(×200倍)。具體實施方式以下將對本專利技術的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本專利技術所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例11、表達NDPV-VP3重組新城疫病毒的構建以新型鴨細小病毒山東分離株為材料，利用RT-PCR方法擴增得到NDPV-VP3基因。參照GenBank收錄的新型鴨細小病毒VP3基因核苷酸序列(GenBankNo.KT343253)設計引物VP3-F、VP3-R，利用Trizol試劑提取NDPV病毒RNA，其擴增產物NDPV-VP3的片段大小為1605bp；擴增產物NDPV-VP3的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。將回收的PCR產物，連接至pMD18-T-Vector，經測序鑒定，NDPV-VP3正確插入到載體中。引物設計如下表：將NDPV-VP3基因與pLMV-RFP線性化載體相連接，并將連接產物轉化至Stbl2感受態細胞，篩選出陽性克隆，得到表達NDPV-VP3的重組NDV病毒質粒。以含本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其特征在于該重組新城疫病毒是通過以下方法構建的：1)取鴨細小病毒，利用RT?PCR方法擴增得到NDPV?VP3基因，回收PCR產物，連接至pMD18?T?Vector；2)將NDPV?VP3基因與pLMV?RFP線性化載體相連接，并將連接產物轉化至Stbl2感受態細胞，篩選出陽性克隆，即得到重組NDV病毒質粒；3)將表達T7聚合酶的重組痘病毒vTF7?3以MOI＝3的滴度接種于單層BHK?21細胞的24孔板內，孵育1h后，將pLMV?VP3、pcDNA?NP、pcDNA?P及pcDNA?L質粒共轉染BHK?21細胞，轉染72h后，將收獲拯救的重組病毒接種10日齡SPF雞胚，收獲HA、HI檢測均為陽性的雞胚尿囊液，即得到重組新城疫病毒rLMV?NDPV?VP3。

【技術特征摘要】
1.一種表達新型鴨細小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其特征在于該重組新城疫病毒是通過以下方法構建的：1)取鴨細小病毒，利用RT-PCR方法擴增得到NDPV-VP3基因，回收PCR產物，連接至pMD18-T-Vector；2)將NDPV-VP3基因與pLMV-RFP線性化載體相連接，并將連接產物轉化至Stbl2感受態細胞，篩選出陽性克隆，即得到重組NDV病毒質粒；3)將表達T7聚合酶的重組痘病毒vTF7-3以MOI＝3的滴度接種于單層BHK-21細胞的24孔板內，孵育1h后，將pLMV-VP3、pcDNA-NP、pcDNA-P及pcDNA-L質粒共轉染BHK-21細胞，轉染72h后，將收獲拯救的重組病毒接種10日齡SPF雞胚，收獲HA、HI檢測均為陽性的雞胚尿囊液，即得到重組新城疫病毒rLMV-NDPV-VP3。2.根據權利要求1所述的重組新城疫病毒，其特征在于步驟1)中RT-PCR擴增的引物序列分別如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示。3.根據權利要求1所述的重組新城疫病毒，其特征在于步驟2)中所述將NDPV-VP3基因與pLMV-RFP線性化載體相連接，具體包括以下操作：A)以含有PHY.LMV42全長cDNA的重組質粒pLMV-RFP為模板，利用引物在質粒pLMV-RFP的RFPORF的兩端通過反向...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭文卿，李亞杰，楊保收，付旭彬，梁武，
申請(專利權)人：天津瑞普生物技術股份有限公司，
類型：發明
國別省市：天津,12