一種細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中病毒顆粒的電鏡定量檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中病毒顆粒的電鏡定量檢測方法。本發(fā)明專利技術(shù)建立的檢測方法，由于加入了非吸附型納米顆粒，在超速離心過程中可通過其表面非特異性吸附的形式吸附低密度病毒顆粒，使得病毒顆粒更多地聚集到銅網(wǎng)上，檢測下限由原先的1×10

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中病毒顆粒的電鏡定量檢測方法
本專利技術(shù)屬于生物
，具體的，本專利技術(shù)涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中病毒顆粒的電鏡定量檢測方法。
技術(shù)介紹
一、細(xì)胞培養(yǎng)的外源因子污染生物制品是采用生物技術(shù)制備而成的具有生物活性的藥品、疫苗、抗體、生化產(chǎn)品等的總稱，其生產(chǎn)工藝復(fù)雜且受多種因素影響，生產(chǎn)過程中使用的各種材料來源復(fù)雜，可能污染細(xì)菌、真菌、支原體和病毒等外源因子，引起產(chǎn)品安全性問題。其中生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞是生物制品生產(chǎn)的一個關(guān)鍵要素，目前國內(nèi)外許多生物制品均是以細(xì)胞基質(zhì)材科為基礎(chǔ)生產(chǎn)生物制品。同時，使用細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)生物制品過程及其復(fù)雜，加之周期長、易污染等客觀因素，導(dǎo)至外源因子污染成為影響生物制品生物安全性的一個極其重要的因素。因此，對生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)及過程進行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，排除外源因子污染，是生物制品生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。鑒于生物制品的應(yīng)用對象是人體免疫或疾病治療。因此，生物制品終產(chǎn)品的質(zhì)量與生物安全性密切相關(guān)，是各國藥品管理機構(gòu)最為關(guān)注的問題，各國藥典中最嚴(yán)格控制的指標(biāo)之一。生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)需建立各級細(xì)胞庫，細(xì)胞庫質(zhì)量是產(chǎn)品質(zhì)量的上游保證，《中華人民共和國藥典，三部，2015版》及《生物制品通則》規(guī)定各級細(xì)胞庫及終產(chǎn)品均需要進行外源因子污染檢定，檢測結(jié)果應(yīng)無外源因子污染。目前，中國藥典規(guī)定對于細(xì)胞外源因子污染的檢測以培養(yǎng)法為主，細(xì)菌、真菌、支原體因其生物學(xué)持性所至，用多種培養(yǎng)方法聯(lián)合檢測基本能檢測出所有的污染物。而對于細(xì)胞內(nèi)、外源病毒污染的檢測，目前采用的體外培養(yǎng)觀察加紅細(xì)胞吸附法、動物體內(nèi)及雞胚接種法等均為間接的檢測方法，不僅檢測周期長，操作復(fù)雜且易受干擾，同時覆蓋的范圍窄，對某些特定病毒，且病毒密度比較低的樣品檢測技術(shù)更為復(fù)雜多樣。因此，急需一種能夠快速、直觀觀察污染的病毒顆粒形態(tài)，且又能同時對低密度病毒進行精確定量的方法，解訣細(xì)胞內(nèi)、外源病毒污染的精確定量檢測問題。二、負(fù)染色電鏡技術(shù)與病毒學(xué)研究電子顯微鏡技術(shù)在自然科學(xué)各個領(lǐng)域中都發(fā)揮了重要的作用，尤其是生物學(xué)、材料科學(xué)、醫(yī)藥衛(wèi)生等相關(guān)學(xué)科，更是不可缺少的工具。負(fù)染色電子顯微鏡技術(shù)在病毒學(xué)研究中常規(guī)使用，尤其對病毒形態(tài)觀察、病毒分類和病毒診斷領(lǐng)域起非常重要的作用。對于特征性病毒，可直觀地立刻做出判定，對于特征不太強的病毒，可結(jié)合其它指標(biāo)綜合判定。負(fù)染色電子顯微鏡定量實驗(QuantitationofViralContaminantsbyNegativeStainElectronMicroscopy)是一項運用負(fù)染色電子顯微鏡觀察待檢測樣品中是否含有病毒顆粒，同時通過直接計數(shù)病毒顆粒，對樣品中的病毒濃度進行定量的技術(shù)。上世紀(jì)70～80年代該技術(shù)已被Gelderblometal(1978)和Hammondetal(1981)用于病毒的定量檢測，基本流程是純化后的病毒與電鏡銅網(wǎng)直接超速離心，電子顯微鏡視野下拍照并直接對病毒顆粒計數(shù)。由于當(dāng)時的實驗條件所限，加之電子顯微鏡技術(shù)參數(shù)設(shè)置差強人意，至使病毒定量誤差較大，難于推廣應(yīng)用。近年來，也有少數(shù)新技術(shù)、新方法問世，但僅限于對高密度(106-7)以上的病毒進行定量，對低密度(103-5)的病毒定量仍無能為力。而對低密度(103-5)的病毒定量，正是細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)、外源病毒污染定量檢測期待的關(guān)鍵技術(shù)。納米顆粒是一種人工制造的、大小不超過100納米的微型顆粒。它的形態(tài)可以是乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒。近年來，納米顆粒越來越多地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、藥物載體及生物活性大分子吸附中。直接用于人體的納米顆粒依其形狀、大小、原始材料、表面大小、帶電荷以及用量、作用時間等方面所表現(xiàn)出的生物毒性差異顯著，需經(jīng)嚴(yán)格的毒理試驗評估后方可使用。而用于離體試驗的標(biāo)準(zhǔn)參照物，更多關(guān)注納米顆粒的大小形狀，表面結(jié)構(gòu)及帶電荷狀態(tài)，相溶牲等，對納米顆粒的選擇余地會更大。納米顆粒根據(jù)表面基團功能的不同，可分為特異性吸附型和非特異性吸附型，前者為特異性穩(wěn)定吸附，是一種典型的生物學(xué)效應(yīng)，后者是一種不穩(wěn)定的吸附聚集現(xiàn)象，產(chǎn)生的是物理吸附作用，結(jié)合力不夠牢固，隨著時間推移，條件的改變，吸附的物體會緩慢脫落，形成分散狀態(tài)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
針對上述問題，本專利技術(shù)提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，由于引入納米顆粒作為負(fù)染色電子顯微鏡定量觀察中的標(biāo)準(zhǔn)參照物，顯著提升病毒定量的靈敏度、精確度，可對待檢細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中低密度(103-5)的病毒進行精確定量，其定量精確度甚至與標(biāo)準(zhǔn)的生物學(xué)測定法(病毒滴度測定法)相當(dāng)。為了達到上述目的，本專利技術(shù)采取以下技術(shù)措施：一種細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，包括下述步驟：1)預(yù)處理：按照常規(guī)離心方式去除待測樣品中的細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，經(jīng)超速離心濃縮后的病毒，用MEM或PBS溶解；2)上樣檢測：將經(jīng)過步驟1)預(yù)處理的待測樣品與納米顆粒混合，將銅網(wǎng)置于該混合物中后超速離心；將銅網(wǎng)取出，清洗后的銅網(wǎng)磷鎢酸負(fù)染，電鏡觀察；3)計數(shù)：若發(fā)現(xiàn)病毒樣顆粒，則對不同網(wǎng)格中的納米顆粒或病毒樣顆粒進行計數(shù)，每個網(wǎng)格至少觀察5個視野，結(jié)果中會給出網(wǎng)格中納米顆粒和病毒樣顆粒各自的數(shù)目，并根據(jù)兩者的比例關(guān)系計算出檢測樣品中病毒樣顆粒的濃度。以上所述的方法中，優(yōu)選的，步驟1)的步驟包括：1、先取待檢測樣品5～10ml，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，于4℃，3000g離心10分鐘。2、將離心好的上清轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中，于4℃，6000g離心20分鐘。3、將離心好的上清轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中，于4℃，10000g離心30分鐘，上清備用。4、取3～5ml備用上清置于超速離心管中，補滿離心管總體積6ml。在ThermoWX100(T8100轉(zhuǎn)子)冷凍超速離心機中4℃，72000g離心2～4小時。5、棄上清，每管加入500～1000ul無血清MEM培養(yǎng)基或PBS重懸，于冰上溶解4小時或過夜，收集樣品于1.5mlEP管中，凍于-80℃冰箱備用。以上所述的方法中，優(yōu)選的，所述的納米顆粒的直徑為100nm；以上所述的方法中，優(yōu)選的，步驟2)中超速離心的速度為100,000×g～120,000×g，離心時間為5～10min；以上所述的方法中，優(yōu)選的，所述的磷鎢酸的濃度為3％(w/v)以上所述的方法中，優(yōu)選的，所述的銅網(wǎng)為200目；以上所述的方法中，優(yōu)選的，步驟2)中，待測樣品與納米顆?；旌蠒r，待測樣品中的病毒數(shù)與納米顆粒的比值范圍是1：1～1：9；以上所述的方法中，優(yōu)選的，所述的納米顆粒的材質(zhì)為合成乳膠。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點：1、檢測周期短，成本低廉：對比常規(guī)方法(體外體內(nèi)培養(yǎng)法)長達2～4周的檢測周期，負(fù)染色電子顯微鏡定量法僅需三個工作日就能完成樣品處理、上樣檢測及結(jié)果分析的完整周期，大大節(jié)約了時間成本和人力成本，能夠高效、快速的完成樣品的病毒污染檢測工作，同時，所用試劑(納米顆粒標(biāo)準(zhǔn)品，染色液等)性狀穩(wěn)定，檢測成本低。2、直觀化、可視化、精確定量：對比傳統(tǒng)的間接培養(yǎng)檢測法，負(fù)染色電鏡檢測法能夠直觀的在電鏡下觀察到各種特異的病毒樣顆粒形態(tài)，實現(xiàn)可視化操作；同時引入已知濃度的非吸附型納米顆粒標(biāo)準(zhǔn)物作為參照，在可視化的基礎(chǔ)上實現(xiàn)對細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中病毒樣顆粒的直接計數(shù)，通過計算獲得樣品中病毒的定量，即每m本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，包括下述步驟：1）預(yù)處理：按照常規(guī)離心方式去除待測樣品中的細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，經(jīng)超速離心濃縮后的病毒，用MEM或PBS溶解；2）上樣檢測：將經(jīng)過步驟1）預(yù)處理的待測樣品與納米顆?；旌?，將銅網(wǎng)置于該混合物中后超速離心；將銅網(wǎng)取出，清洗后的銅網(wǎng)磷鎢酸負(fù)染，電鏡觀察；3）計數(shù)：若發(fā)現(xiàn)病毒樣顆粒，則對不同網(wǎng)格中的納米顆?；虿《緲宇w粒進行計數(shù)，每個網(wǎng)格至少觀察5個視野，結(jié)果中會給出網(wǎng)格中納米顆粒和病毒樣顆粒各自的數(shù)目，并根據(jù)兩者的比例關(guān)系計算出檢測樣品中病毒樣顆粒的濃度。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，包括下述步驟：1）預(yù)處理：按照常規(guī)離心方式去除待測樣品中的細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，經(jīng)超速離心濃縮后的病毒，用MEM或PBS溶解；2）上樣檢測：將經(jīng)過步驟1）預(yù)處理的待測樣品與納米顆粒混合，將銅網(wǎng)置于該混合物中后超速離心；將銅網(wǎng)取出，清洗后的銅網(wǎng)磷鎢酸負(fù)染，電鏡觀察；3）計數(shù)：若發(fā)現(xiàn)病毒樣顆粒，則對不同網(wǎng)格中的納米顆?；虿《緲宇w粒進行計數(shù)，每個網(wǎng)格至少觀察5個視野，結(jié)果中會給出網(wǎng)格中納米顆粒和病毒樣顆粒各自的數(shù)目，并根據(jù)兩者的比例關(guān)系計算出檢測樣品中病毒樣顆粒的濃度。2.根據(jù)權(quán)利要去1所述的方法，所述的步驟1）的步驟包括：1）、先取待檢測樣品5~10ml，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，于4℃，3000g離心10分鐘；2）、將離心好的上清轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中，于4℃，6000g離心20分鐘；3）、將離心好的上清轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中，于4...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：袁冰，張智，李姣，
申請(專利權(quán))人：武漢珈創(chuàng)生物技術(shù)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：湖北,42