非糖基化人甲胎蛋白、制備方法及其應用技術

本發明專利技術的特征為非糖基化人甲胎蛋白、制備方法及其應用。（*該技術在2024年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
技術介紹
本專利技術涉及非糖基化人甲胎蛋白、其在轉基因動物和植物中的制備方法及其應用。甲胎蛋白(AFP)是一種70kDa糖蛋白，由卵黃囊和胎肝產生。AFP在胎兒血清中的含量為毫克水平，在出生時，下降至納克水平，在成人血清中通常也是納克水平；當成人血清中AFP水平升高時，表明有卵黃囊腫瘤、肝細胞瘤或肝臟再生。AFP在胎兒發育期間的作用尚不清楚，盡管已經知道AFP保護妊娠中的胎兒免遭母體免疫攻擊或者免遭母體雌激素的影響。體外和體內實驗證明，AFP既具有細胞生長刺激活性又具有細胞生長抑制活性，這取決于靶細胞、AFP相對濃度和其它細胞因子和生長因子的存在。例如，AFP可抑制多種腫瘤細胞的生長，具體地講，抑制雌激素刺激的細胞生長。相反，AFP刺激正常胚胎成纖維細胞的生長。AFP也顯示出具有免疫抑制效應和免疫增生效應。為了開發利用AFP的各種生物學特性，有必要以有效而劃算的方式得到足夠量的該分子。已經證明，在重組系統中表達AFP是困難的，因為在真核細胞中表達野生型AFP通常會因為AFP在一個天冬酰胺殘基(氨基酸233)上的差別糖基化而產生幾種同工型。在原核系統中表達AFP通常產生錯折疊和無活性的蛋白，它們聚集在一起，沒有恰當的內部二硫鍵。這樣錯折疊的AFP必須經過純化，然后在允許形成16個二硫鍵的條件下，經過困難而耗時的重折疊過程，以非常低的總收率產生有用的活性蛋白質。因為AFP的非糖基化形式與糖基化形式表現出相同的生物學特性，并且因為沒有糖基化的變異性而允許產生更標準化、穩定的產品，所以非糖基化AFP優選用于商業生產。因此，需要有效方法，以生產非糖基化人AFP用于商業和治療性應用。專利技術概述本專利技術的特征為基本純的核酸分子，所述分子編碼非糖基化人甲胎蛋白(ng.HuAFP)或其非糖基化片段。在一個實施方案中，編碼ng.HuAFP的核酸分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874。本專利技術的另一特征為包含非糖基化人甲胎蛋白的多肽。在本專利技術的這一特征的一個實施方案中，所述多肽是基本純的并且具有SEQID NO6中所示的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽是基本純的并且具有SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列。本專利技術還包括非糖基化重組HuAFP的生物活性片段及其類似物。在一個實施方案中，非糖基化重組HuAFP的生物活性片段包含SEQ ID NO15中所示的氨基酸序列(結構域II)、SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列(結構域I+II)、或SEQ ID NO17中所示的氨基酸序列(結構域II+III)、或兩個或更多個上述氨基酸序列。本專利技術的另一特征為基本純的核酸分子，所述分子包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)啟動子，所述啟動子與ng.HuAFP編碼序列操作性連接并且使ng.HuAFP能表達，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使細胞能分泌ng.HuAFP。在一個實施方案中，所述細胞是原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細胞(例如酵母細胞(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)或動物細胞(例如哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)。在一個理想的實施方案中，所述細胞將ng.HuAFP分泌到細胞培養基(即非生物體液)中。在另一個實施方案中，所述真核細胞是在轉基因動物(例如哺乳動物，例如山羊、綿羊、駱駝、牛、豬、兔、馬或美洲駝)中。在又一個實施方案中，所述細胞是轉基因動物的生物體液產生細胞，所述啟動子使生物體液產生細胞中能表達ng.HuAFP，所述前導序列使ng.HuAFP能分泌到轉基因動物的生物體液(例如乳汁、尿液、血液或淋巴液)中。在一個實施方案中，表達ng.HuAFP的細胞是在轉基因動物中，驅動ng.HuAFP表達的啟動子是乳汁產生細胞特異性啟動子，其使ng.HuAFP在動物的乳汁產生細胞中表達，所述前導序列使ng.HuAFP能分泌到動物乳汁中。在另一個實施方案中，表達ng.HuAFP的細胞是在轉基因動物中，驅動ng.HuAFP表達的啟動子是尿液產生細胞特異性啟動子，其使ng.HuAFP在動物的尿液產生細胞中表達，所述前導序列使ng.HuAFP能分泌到動物尿液中。在又一個實施方案中，表達ng.HuAFP的細胞是在轉基因動物中，驅動ng.HuAFP表達的啟動子是血液產生細胞特異性啟動子，其使ng.HuAFP在動物的血液產生細胞中表達，所述前導序列使ng.HuAFP能分泌到動物血液中。在再一個實施方案中，表達ng.HuAFP的細胞是在轉基因動物中，驅動ng.HuAFP表達的啟動子是淋巴液產生細胞特異性啟動子，其使ng.HuAFP在動物的淋巴液產生細胞中表達，所述前導序列使ng.HuAFP能分泌到動物淋巴液中。本專利技術的另一特征為非人類轉基因生物，所述生物表達ng.HuAFP并將其分泌到生物體液(例如乳汁、尿液、唾液、精液或陰道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黃囊、絨毛膜或尿囊內的液體、血液、汗液和淚液；或者是植物產生的水溶液，包括例如滲出液或吐水液、木質部、韌皮部、樹脂和花蜜)中。在一個實施方案中，所述轉基因生物是哺乳動物(例如例如山羊、綿羊、駱駝、牛、豬、兔、馬或美洲駝)、鳥類、爬行動物、兩棲動物或植物。在另一個實施方案中，ng.HuAFP是由轉基因表達，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)與ng.HuAFP編碼序列操作性連接的啟動子，致使所述啟動子使所述生物的細胞能表達ng.HuAFP并能將蛋白分泌到生物體液中，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列能使所述生物的細胞將ng.HuAFP分泌到生物體液中。在又一個實施方案中，所述啟動子是乳汁特異性啟動子、尿液特異性啟動子、血液特異性啟動子或淋巴液特異性啟動子，所述前導序列使ng.HuAFP能分別分泌到生物體的乳汁、尿液、血液或淋巴液中。在再一個實施方案中，所述生物是小鼠或山羊。本專利技術的另一特征為包括ng.HuAFP的非人類哺乳動物乳汁、尿液、血液或淋巴液。在一個實施方案中，ng.HuAFP是可溶性的，并且由非人類轉基因哺乳動物產生，所述動物的乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞表達轉基因，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)乳汁特異性啟動子、尿液特異性啟動子、血液特異性啟動子或淋巴液特異性啟動子，致使所述啟動子與ng.HuAFP編碼序列操作性連接并且使得所述哺乳動物的乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞能夠表達ng.HuAFP，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列能使乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞將ng.HuAFP分別分泌到所述哺乳動物的乳汁、尿液、血液或淋巴液中。本專利技術的另一特征為通過下述步驟產生ng.HuAFP的方法(a)提供用轉基因轉導的細胞，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種核酸分子，所述分子編碼非糖基化人甲胎蛋白（ｎｇ．ＨｕＡＦＰ）或其非糖基化片段。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：R穆爾羅伊，I克蘭，
申請(專利權)人：梅里麥克藥品公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]