一種純化氧化含二硫鍵多肽的方法技術

本發明專利技術涉及一種純化氧化含二硫鍵多肽的方法，將待純化氧化的粗肽在色譜柱上進行分離，同時進行氧化；其是將粗肽以流動相A相和B相進行沖洗，在純化的同時進行二硫鍵的氧化，純化后得到的就是氧化后的多肽；其中，A相中包含氧化二硫鍵的氧化劑。發明專利技術提供的液相二硫鍵氧化方法，區別于傳統氧化思路，可以彌補固相氧化收率低、傳統液相氧化方法費時費力的缺點，大大提高收率，并且易于放大生產。

Method for purifying oxidized polypeptide containing two sulfur bond

The invention relates to a method for purification of oxide containing two disulfide bond polypeptide, crude peptide will be purified oxidation were separated on the column, while the crude peptide oxidation; the mobile phase in A phase and B phase for flushing, oxidation of two disulfide bonds in purified and purified is after the oxidation of the polypeptide; oxidant A phase contains two disulfide oxidation. The invention provides a liquid phase two disulfide oxidation method, different from the traditional oxidation of ideas, can make up for the solid phase oxidation of low yield and traditional liquid phase oxidation methods are time-consuming shortcomings, greatly improve the yield, and it is easy to enlarge the production.

【技術實現步驟摘要】
一種純化氧化含二硫鍵多肽的方法
本專利技術涉及一種多肽藥物的純化方法。
技術介紹
一對或多對半胱氨酸殘基之間所形成的二硫鍵對維持多肽空間構象以及某些生物學活性起著重要的作用。現有的許多藥物都需要二硫鍵的存在才具有活性，例如如：奧曲肽、奈西立肽、愛啡肽、阿托西班和特利加壓素等等，因此二硫鍵的氧化方法一直是多肽行業研究的重點。目前多肽二硫鍵氧化的常規方法是先采用空氣、雙氧水、碘等氧化劑進行氧化，再利用反相液相色譜進行純化，得到最終產物。此方法雖然在15min-30min即可完成氧化，氧化速度較快，但停止氧化反應后還需要經過反相液相色譜純化，才能得到所需的產物。而不同的氧化方法，在進行下一步反相色譜純化前的處理過程也不相同。例如愛啡肽按照常規方法用雙氧水氧化后，溶液體積較大，需多重過濾后方可進行純化；奈西利肽先用氧氣氧化，再經過旋蒸、過濾后，方可進行純化，等等。這些方法的步驟都過于繁瑣，需控制的參數也多，不利于對多肽質量的控制。多肽的穩定性本身較差，特別對于一些性質極不穩定的多肽而言，在終止氧化反應后，進行后續步驟之前，強氧化劑就有可能已經破壞了多肽本身的結構，引起多肽變性。所以減少氧化操作步驟，縮短處理時間對提高氧化收率，控制產品質量顯得尤為重要。本專利技術為解決這些問題，提供了一種在純化的同時完成多肽氧化的方法。不僅簡化了操作過程，縮短了整個工藝的處理時間，更加避免了多肽與強氧化劑長時間接觸引起的結構不穩定，所導致的收率降低。對于多肽的二硫鍵氧化主要有以下幾種方式，一是多肽固相或液相合成過程中進行氧化，經過裂解后，得到的就是氧化產物，然后進行純化，如：CN102827249A；二是固相合成線性粗肽，裂解后將線性粗肽溶解后進行液相氧化，然后再進行純化如：CN103304655A、CN104710509A；或是將線性粗肽純化提高純度后再進行二硫鍵氧化，以提高氧化產物純度或反應效率，但是每種二硫鍵氧化方法都有其優缺點，固相氧化對某些短肽或某些只需成一對二硫鍵的多肽更為合適；液相氧化費時費力，但氧化后的純度相對較高，對于后續純化提供了便利。為了提高藥物的安全性，現有多肽藥物要求純度越高越好，大多要求純度大于99％，并需對單雜進行控制，要求單雜小于0.15％，固相氧化雜質較多，不利于質量控制；如果采用液相氧化后進行純化，雖然液相氧化完全，純度較高，但氧化處理工序較繁瑣，費時費力。本專利技術提供了一種新液相二硫鍵氧化方法，區別于傳統氧化思路，可以彌補固相氧化收率、純度低，傳統液相氧化方法費時費力的缺點，操作簡便的同時大大提高氧化純度及收率，并且易于放大生產。
技術實現思路
本專利技術涉及一種新的液相氧化方法，將多肽藥物線性粗肽直接在制備色譜柱上實現二硫鍵氧化。主要是以含有氧化劑的溶液為A1相，以有機溶劑為B相，在色譜柱上梯度洗脫多肽藥物的同時，對多肽藥物線性肽進行氧化，收集到的樣品即為氧化后的多肽原料藥。本專利技術涉及一種純化氧化含二硫鍵多肽的方法，將待純化氧化的粗肽在色譜柱上進行分離，同時進行氧化；其是將粗肽以包含氧化劑的流動相進行洗脫同時氧化；優選地，包括以下步驟：將粗肽以流動相A相和B相進行沖洗，其中，A相為無機鹽水溶液，A相中還包含氧化二硫鍵的氧化劑；進一步地，A相中所述氧化劑選自雙氧水、DMSO、碘以及金屬離子氧化劑(Fe3+、Cu2+、Ag+)的一種或者幾種；優選地，金屬離子氧化劑選自Fe2O3。進一步地，A相中的氧化劑為雙氧水或DMSO，且A相的pH為7.5-9.0。進一步地，A相中的氧化劑為碘，且其pH為2.5-9.0，優選為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。進一步地，所述氧化劑摩爾數為粗肽摩爾數的2-10倍，優選3、4、5、6、7、8、9倍。進一步地，A相中包含水和無機鹽，B相中包含有機溶劑，優選地，B相中包含乙腈、甲醇、異丙醇、乙醇、四氫呋喃中的一種或多種，無機鹽選自磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉中的一種或多種。進一步地，所述色譜柱固定相選自硅膠基質、聚合物高分子、氧化鋯。進一步地，含二硫鍵多肽選自奧曲肽、愛啡肽、奈西立肽、阿托西班、特利加壓素、齊考諾肽、利那洛肽、去氨加壓素等。本專利技術所用洗脫程序和洗脫劑可以采用任何能夠將多肽進行分離的程序和洗脫劑。進一步地，洗脫程序為，將無機鹽溶液作為流動相A相，在A相中加入氧化劑，混合均勻；以色譜純甲醇為B相。以60-80ml/min的流速，檢測波230nm。B相洗脫梯度：B％：15％—35％，50-70min。進一步地，洗脫程序為，將無機鹽溶液作為流動相A，并添加入氧化劑，混合均勻；色譜純甲醇作為B相。流速：200ml/min。檢測波長：230nm。B相洗脫梯度：B％：8％—20％，50-70min。進一步地，洗脫程序為，將無機鹽溶液作為流動相A，并添加入氧化劑，混合均勻；乙腈作為B相。流速：200ml/min。檢測波長：230nm。B相乙腈洗脫梯度：B％：18％—28％，50-70min。進一步地，洗脫程序為，將無機鹽溶液作為流動相A，并添加入氧化劑，混合均勻；乙醇作為B相。流速：200ml/min。檢測波長：220nm。B相乙醇洗脫梯度：B％：25％—45％，50-70min。本專利技術通過將氧化和純化合二為一，一步完成，省時省力，氧化的同時實現粗肽中的異構體雜質和其他難分離雜質的有效分離，然后利用反相HPLC方法轉成醋酸鹽或者其它成鹽形式，最終提高了產品的收率和純度。同時解決了固相氧化收率、純度低，液相氧化費時費力的缺點。本方法操作簡便，有利于實現規模化的制備，提供了一種液相氧化的新方法。本法明所述色譜柱為硅膠基質、聚合物高分子、氧化鋯類型的反相色譜柱，包括C1、C4、C8、C18等類型色譜柱。均可用于該液相二硫鍵氧化方法的固定相。所有可以溶解二硫鍵氧化劑的溶液均可以作為本專利技術的洗脫流動A相，包括水、各種無機鹽等。B相可以為各種有機相，如乙腈、甲醇、異丙醇等等。本專利技術所述pH限定范圍，依據二硫鍵氧化方式不同而不同，對于雙氧水、空氣、DMSO需在堿性環境中進行的氧化方式，pH限定范圍7.5-9.0；采用碘氧化時，pH限定范圍為2.5-9.0；金屬離子做二硫鍵氧化劑適合所有pH，優選pH范圍為1.5-11.5.本專利技術所涉及的二硫鍵氧化劑較多，不限于DMSO、雙氧水、碘以及金屬離子氧化劑的一種或者幾種，只要溶于洗脫流動相中的氧化劑均可作為本專利技術的氧化劑。本專利技術所述氧化劑濃度主要是根據待純化物質摩爾數的2-10倍。附圖說明圖1為線性粗肽質譜。圖2為精肽質譜。圖3為實施例1分離純化后HPLC譜圖。圖4為實施例2分離純化后HPLC譜圖。圖5為實施例3分離純化后HPLC譜圖。圖6為實施例4分離純化后HPLC譜圖。圖7為實施例5分離純化后HPLC譜圖。具體實施方式可使用的不同色譜柱規格包括：5cm×25cm(柱子直徑×長度)、10cm×25cm、15cm×25cm。實施例1：奧曲肽粗肽純化將奧曲肽線性粗肽2.0g溶解過濾，收集濾液備用。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠色譜柱，色譜柱規格為5cm×25cm。制備過程：將100mmol/L的磷酸二氫鉀溶液用氨水調pH至8.5作本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種純化氧化含二硫鍵多肽的方法，將待純化氧化的粗肽在色譜柱上進行分離，同時進行氧化；其是將粗肽以包含氧化劑的流動相進行洗脫同時氧化；優選地，將粗肽以流動相A相和B相進行洗脫，其中，A相為無機鹽水溶液，A相中還包含氧化二硫鍵的氧化劑。

【技術特征摘要】
1.一種純化氧化含二硫鍵多肽的方法，將待純化氧化的粗肽在色譜柱上進行分離，同時進行氧化；其是將粗肽以包含氧化劑的流動相進行洗脫同時氧化；優選地，將粗肽以流動相A相和B相進行洗脫，其中，A相為無機鹽水溶液，A相中還包含氧化二硫鍵的氧化劑。2.根據權利要求1所述的純化氧化含二硫鍵多肽的方法，其中，A相中所述氧化劑選自雙氧水、DMSO、碘以及金屬離子氧化劑(Fe3+、Cu2+、Ag+)的一種或者幾種；優選地，金屬離子氧化劑選自Fe2O3。3.根據權利要求1-2任一項所述的純化氧化含二硫鍵多肽的方法，其中，A相中的氧化劑為雙氧水或DMSO，且A相的pH為7.5-9.0。4.根據權利要求1-2任一項所述的純化氧化含二硫...

【專利技術屬性】
技術研發人員：尹傳龍，宓鵬程，陶安進，袁建成，
申請(專利權)人：深圳翰宇藥業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44