一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法技術

本發(fā)明專利技術提供了一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，該技術方案依托于一種特異性識別TEM1蛋白的單鏈抗體，結合減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009的腫瘤內(nèi)特異性聚集及胞內(nèi)侵襲的特性，攜帶細胞凋亡誘導因子Aif達到特異性殺傷腫瘤的效果。具體來看，本發(fā)明專利技術首先構建了Abvec?Igk?Aif、Abvec?Igk?T18?Aif重組質(zhì)粒，經(jīng)擴增后通過電擊轉化的方式導入鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株，利用減毒鼠傷寒沙門氏菌胞內(nèi)侵襲的特性，以HEK293?T細胞為宿主實現(xiàn)蛋白的表達，最后利用含青霉素、鏈霉素的血清培養(yǎng)基殺死細胞內(nèi)外的減毒鼠傷寒沙門氏菌，使重組質(zhì)粒釋放至真核細胞中，經(jīng)細胞破碎后即得到含有目的蛋白的上清液，該上清液即屬于本發(fā)明專利技術所述藥物的一種存在形式。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法
本專利技術涉及分子生物學
，進一涉及基因重組與轉染方法的研究，同時涉及目的蛋白的表達及其功能驗證，具體涉及一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法。
技術介紹
細胞凋亡誘導因子(apoptosisinducingfactor，AIF)，是一類存在于線粒體內(nèi)外膜之間的保守的黃素蛋白，可誘導Caspase非依賴性細胞凋亡。人的AIF基因位于Xq25-26，其轉錄產(chǎn)生的mRNA的長度為2.4kb，編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)有三個不同長度的可變剪接體，它們的氨基酸數(shù)分別為613、609和326。除可誘導細胞凋亡外，AIF兼具氧化還原酶的活性。當細胞受到特定的凋亡誘導信號的刺激后，線粒體膜上的通透性孔道(mitochondrialpermeabilitytransitionpores，MPTP)打開，允許AIF從線粒體釋放到胞漿，并進入細胞核中，和另一個線粒體蛋白endonucleaseG(EndoG)一起，引起核內(nèi)DNA凝集并斷裂成50kb大小的片段在介導細胞凋亡過程時，AIF有兩個方面的作用：一是可以作為細胞凋亡的起始因子，二是可以作為細胞凋亡的直接效應因子。在正常的情況下，AIF存在于線粒體中，可以清除細胞內(nèi)的自由基從而阻止細胞凋亡；當細胞受到凋亡刺激后。AIF首先從線粒體出來，然后轉移至細胞質(zhì)中，最后轉移到細胞核中發(fā)揮促進細胞凋亡的作用。內(nèi)皮唾液酸蛋白(TEM1/CD248)是Ⅰ型跨膜蛋白，由一個被糖基化修飾的80.9KDa的蛋白核心區(qū)組成，修飾后成熟的糖蛋白大約在175KDa。TEM1是近期發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤標記物之一，其對腫瘤的細胞生長血管生成浸潤及轉移有重要作用。TEM1外部分由五個球狀結構域(N端的C型凝集素結構域，壽司樣結構域，和三個表皮生長因子(EGF)樣重復)和一個粘蛋白樣區(qū)組成，其中核心蛋白大量唾液酸化與血栓調(diào)節(jié)蛋白相似。對于成體組織，TEM1的表達分布是這樣的：子宮>腎小球>輸卵管血管>心和肺>其他組織；另外，在內(nèi)皮祖細胞中TEM1表達量相對很少。然而，在以下腫瘤中TEM1都有高表達，如肉瘤，腦腫瘤，乳腺癌，皮膚癌、結腸癌，且實驗表明在卵巢癌中，TEM1表達與腫瘤的浸潤、預后密切相關。因此，TEM1在正常組織不表達或者低表達，而在腫瘤血管組織高表達的特點，預示了TEM1作為腫瘤診斷和治療的靶標分子的潛力。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷，提供一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，以解決現(xiàn)有技術中天然結構的細胞凋亡誘導因子AIF對腫瘤細胞的攻擊缺乏靶向作用。本專利技術要解決的另一技術問題是現(xiàn)有技術中缺乏一種AIF與抗體偶聯(lián)的靶向抗腫瘤藥物。本專利技術要解決的再一技術問題是在獲得了整合有AIF-單鏈抗體復合物的表達基因的重組質(zhì)粒的情況下，現(xiàn)有技術中對此類質(zhì)粒的表達方法操作繁瑣、蛋白表達水平較低。為實現(xiàn)以上技術目的，本專利技術采用以下技術方案：一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：1)取序列如SEQIDNo.1所示的T18-AIF表達基因、序列如SEQIDNo.2所示的AIF表達基因，分別通過酶切方式與Abvec-Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；2)分別取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細胞E.coliTop10中進行質(zhì)粒擴增；3)分別收集步驟2)擴增后的重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分別通過電轉法導入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述電轉法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉4.7ms；4)取HEK293-T細胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細胞量為1:80～1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，或者取HEK293-T細胞與載體菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的細胞量為1:80～1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)4～16h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h，而后破碎細胞收集上清。作為優(yōu)選，所述T18-AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。作為優(yōu)選，所述AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.6所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。作為優(yōu)選，步驟1)所述酶切方式是經(jīng)AgeI和BsiwI雙酶切，對酶切產(chǎn)物純化后，采用T4連接酶連接到Abvec-Igk質(zhì)粒中。作為優(yōu)選，步驟3)所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株，是通過以下方法制備的：A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；B)挑取單菌落接種于3～7mlLB液體培養(yǎng)基中，35～39℃振蕩培養(yǎng)10～14h；C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80～1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值不小于0.4；D)冰浴15～25min后，離心取沉淀用1/8～1/12體積預冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80～1/120體積預冷的、8～12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80～1/120體積預冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。作為優(yōu)選，HEK293-T細胞的加入量為8000～12000個/孔；HEK293-T細胞與載體菌株在細胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為380～420μL。作為優(yōu)選，所述針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。在以上技術方案中，所述Abvec-Igk質(zhì)粒明確限定為：NCBIGenBank中編號為FJ475056的質(zhì)粒，該質(zhì)粒的基因序列如SEQIDNo.3所示。因此本專利技術中所述Abvec-Igk質(zhì)粒不具有其他指向作用或概況作用。在以上技術方案中，所述T18是一種特異性識別TEM1的單鏈抗體，該抗體的名稱(即T18)屬于自創(chuàng)詞匯。所述T18-Aif表達基因是指整合有Aif表達基因的重組單鏈抗體T18的表達基因。作為一種自創(chuàng)詞匯，T18-Aif表達基因的技術特征是由序列如SEQIDNo.1所示的DNA表征的；在知曉該具體序列的情況下，T18-Aif表達基因可以通過本領域中常規(guī)的DNA合成方法獲得，當然也可以利用以上優(yōu)選技術方案中所披露的PCR方法獲得。本專利技術提供了一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，該技術方案依托于一種特異性識別TEM1蛋白的單鏈抗體，結合減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009的腫瘤內(nèi)特異性聚集及胞內(nèi)侵襲的特性，攜帶細胞凋亡誘導因子Aif達到特異性殺傷腫瘤的效果。具體來看，本專利技術首先構建了Abvec-Igk-Aif、Abvec-Igk-T1本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于包括以下步驟：1)取序列如SEQ?ID?No.1所示的T18?AIF表達基因、序列如SEQ?ID?No.2所示的AIF表達基因，分別通過酶切方式與Abvec?Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec?Igk?T18?Aif、Abvec?Igk?Aif；2)分別取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec?Igk?T18?Aif、Abvec?Igk?Aif，在宿主細胞E.coli?Top10中進行質(zhì)粒擴增；3)分別收集步驟2)擴增后的重組質(zhì)粒Abvec?Igk?T18?Aif、Abvec?Igk?Aif，分別通過電轉法導入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec?Igk?T18?Aif?VNP20009和Abvec?Igk?Aif?VNP20009；所述電轉法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉4.7ms；4)取HEK293?T細胞與載體菌株Abvec?Igk?T18?Aif?VNP20009以二者的細胞量為1:80～1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，或者取HEK293?T細胞與載體菌株Abvec?Igk?Aif?VNP20009以二者的細胞量為1:80～1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)4～16h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h，而后破碎細胞收集上清。...

【技術特征摘要】
1.一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于包括以下步驟：1)取序列如SEQIDNo.1所示的T18-AIF表達基因、序列如SEQIDNo.2所示的AIF表達基因，分別通過酶切方式與Abvec-Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；2)分別取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細胞E.coliTop10中進行質(zhì)粒擴增；3)分別收集步驟2)擴增后的重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分別通過電轉法導入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述電轉法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉4.7ms；4)取HEK293-T細胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細胞量為1:80～1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，或者取HEK293-T細胞與載體菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的細胞量為1:80～1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)4～16h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h，而后破碎細胞收集上清。2.根據(jù)權利要求1所述的一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于所述T18-AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。3.根...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：陳廷濤，辛洪波，王鑫，
申請(專利權)人：南昌大學，
類型：發(fā)明
國別省市：江西,36