脂肪酶變體以及編碼它們的多核苷酸制造技術

本發明專利技術涉及脂肪酶變體。本發明專利技術還涉及編碼這些變體的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構建體、載體、以及宿主細胞；以及使用這些變體的方法。

Lipase variants and polynucleotides encoding them

The invention relates to a lipase variant. The present invention also relates to polynucleotides encoding these variants; nucleic acid constructs, vectors, and host cells comprising these polynucleotides, and methods of using these variants.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】對序列表的引用本申請包含計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結合在此。專利技術背景專利
本專利技術涉及脂肪酶變體、編碼這些變體的多核苷酸、產生這些變體的方法以及使用這些變體的方法。相關領域描述在一些情況下脂肪酶的使用會伴隨著氣味的發展。已知的是，具有脂肪酶的衣物洗滌劑有時留下殘余的氣味附著到牛奶污染的衣物上(EP430315)，并且感興趣的是最小化產生氣味的短鏈脂肪酸的形成。具有獲得的良好有效的清潔的感知可能由于氣味發展的存在而受到負面影響。清洗組合物已經與不同類型的芳香劑一起配制以掩蔽氣味，但因為很多原因并非總是可能包括這樣的成分。因此，具有降低的或低的氣味發展的脂肪酶的可用性將是所希望的。本專利技術提供脂肪酶變體，與親本酶相比，該脂肪酶變體發展低水平的或降低的水平的氣味。專利技術概述本專利技術涉及脂肪酶變體，該脂肪酶變體包括在對應于SEQIDNO:2的位置210(不是帶負電荷的氨基酸)和位置255(不是I)的位置的取代，并且其中位置256不是K，并且其中該變體具有脂肪酶活性，并且與SEQIDNO:2具有至少60％但小于100％的序列一致性。本專利技術還涉及編碼這些變體的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構建體、載體、以及宿主細胞；以及產生這些變體的方法。本專利技術還涉及包括本專利技術的變體的組合物和清潔表面的方法，該方法包括將表面與該組合物接觸。定義脂肪酶：術語“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipaseenzyme)”、“脂解酶”、“脂質酯酶”、“脂解多肽”以及“脂解蛋白”是指如酶命名法所定義的EC3.1.1類中的一種酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC3.1.1.3)、角質酶活性(EC3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC3.1.1.13)和/或蠟酯水解酶活性(EC3.1.1.50)。出于本專利技術的目的，根據實例部分中所述的程序確定脂肪酶活性：可以使用具有不同鏈長的底物，用PnP測定確定水解活性；并且可以在AMSA中監測洗滌性能。在一方面，本專利技術的變體具有SEQIDNO:2的多肽的脂肪酶活性的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％。等位基因變體：術語“等位基因變體”意指占據同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可替代形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產生，并且可以導致群體內的多態性。基因突變可以是沉默的(在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。cDNA：術語“cDNA”是指可以通過從得自真核或原核細胞的成熟的、剪接的mRNA分子進行反轉錄而制備的DNA分子。cDNA缺少可以存在于相應基因組DNA中的內含子序列。早先的初始RNA轉錄本是mRNA的前體，其在呈現為成熟的剪接的mRNA之前要經一系列的步驟進行加工，包括剪接。編碼序列：術語“編碼序列”意指直接指明變體的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由一個開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開始并且以一個終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結束。編碼序列可以是一種基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。控制序列：術語“控制序列”意指對于表達編碼本專利技術的變體的多核苷酸所必需的核酸序列。每個控制序列對于編碼該變體的多核苷酸來說可以是原生的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是原生的或外源的。這些調控序列包括但不局限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。至少，控制序列包括啟動子，以及轉錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供有多個接頭。表達：術語“表達”包括涉及變體產生的任何步驟，包括但不限于，轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。表達載體：術語“表達載體”意指線性或環狀DNA分子，該分子包括編碼變體的多核苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達的控制序列相連接。片段：術語“片段”意指從多肽的氨基和/或羧基末端缺少一個或多個(例如，若干個)氨基酸的多肽；其中該片段具有脂肪酶活性。在一方面，片段包含SEQIDNO:2的氨基酸1至269的數目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，但是小于100％。高嚴格條件：術語“高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在65℃下使用2XSSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。宿主細胞：術語“宿主細胞”意指易于用包含本專利技術的多核苷酸的核酸構建體或表達載體轉化、轉染、轉導等的任何細胞類型。術語“宿主細胞”涵蓋由于復制期間發生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。改進的特性：術語“改進的特性”意指與變體相關的與親本相比得到改進的特征。本專利技術的變體的改進的特性是與親本酶或SEQIDNO:2的脂肪酶相比具有一個低的水平的或降低的水平的氣味的發展。這個性能可以通過在“實例”部分中描述的測定確定，并且可以單獨表示為氣味，或效險比(B/R)，也如在“實例”部分中定義的。分離的：術語“分離的”意指處于自然界中不存在的形式或環境中的物質。分離的物質的非限制性實例包括(1)任何非天然存在的物質，(2)包括但不局限于任何酶、變體、核酸、蛋白質、肽或輔因子的任何物質，該物質至少部分地從與其本質相關的一種或多種或所有天然存在的成分中去除；(3)相對于天然發現的物質通過人工修飾的任何物質；或(4)通過相對于與其天然相關聯的其他組分，增加該物質的量而修飾的任何物質(例如，編碼該物質的基因的多個拷貝；比與編碼該物質的基因天然相關聯的啟動子更強的啟動子的使用)。分離的物質可以存在于發酵液樣品中。低嚴格條件：術語“低嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在50℃下使用2XSSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。成熟多肽：術語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸1至269。本領域已知，宿主細胞可以產生由同一多核苷酸表達的兩種或更多種不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。成熟多肽編碼序列：術語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸1至810。中嚴格條件：術語“中嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準D本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種脂肪酶變體，該脂肪酶變體包括在對應于SEQ?ID?NO:2的位置210的位置的不是帶負電荷的氨基酸的取代和在對應于SEQ?ID?NO:2的位置255的位置的不是I的取代，并且其中位置256不是K，并且其中該變體具有脂肪酶活性，并且與SEQ?ID?NO:2具有至少60％但小于100％的序列一致性。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.09.29 EP 14186789.51.一種脂肪酶變體，該脂肪酶變體包括在對應于SEQIDNO:2的位置210的位置的不是帶負電荷的氨基酸的取代和在對應于SEQIDNO:2的位置255的位置的不是I的取代，并且其中位置256不是K，并且其中該變體具有脂肪酶活性，并且與SEQIDNO:2具有至少60％但小于100％的序列一致性。2.如權利要求1所述的變體，其中該變體進一步包括在對應于位置33，91，231和/或233的位置的取代。3.如權利要求1-2中任一項所述的變體，其中在33的取代是K或Q；91是Q，210是A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；231是H、K或R；233是H、K或R；255是A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；256是A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。4.如權利要求1-3中任一項所述的變體，該變體選自下組，該組由以下各項組成：a.一種多肽，該多肽與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性；b.一種多肽，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸在低嚴格條件、中等嚴格條件、中-高嚴格條件、高嚴格條件、或非常高嚴格條件下與以下雜交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，或(ii)(i)的全長互補體；c.一種多肽，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的一致性；以及d.SEQIDNO:2的成熟多肽的一個片段，該片段具有脂肪酶活性。5.如權利要求1-4中任一項所述的變體，該變體包括在以下位置的取代或由其組成:對應于位置210+255的兩個位置，在對應于位置210+231+255的三個位...

【專利技術屬性】
技術研發人員：CH漢森，J維德，L埃爾蘭德森，B普萊斯納，ACO斯滕霍爾姆，
申請(專利權)人：諾維信公司，
類型：發明
國別省市：丹麥;DK