多功能熒光蛋白納米線及其介導的免疫分析方法技術

本發明專利技術提供一種多功能熒光蛋白納米線，包括蛋白納米線以及連接在蛋白納米線外側的熒光分子，蛋白納米線通過成線蛋白自組裝形成，本發明專利技術多功能熒光蛋白納米線以熒光分子作為信號分子，在位于多功能熒光蛋白納米線兩端的熒光分子表面修飾功能配體作為結合分子，可用于提高免疫檢測尤其是蛋白芯片檢測靈敏度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及免疫分析領域，特別涉及一種多功能熒光蛋白納米線及其介導的免疫分析方法。
技術介紹
蛋白微陣列分析(ProteinMicroarray)技術又稱蛋白芯片技術，可用于大規模蛋白質相互作用篩查、高通量靶標蛋白檢測、各種蛋白質譜學分析、蛋白-核酸相互作用分析、蛋白質-小分子(藥物篩選)相互作用分析等。其基本原理類似于酶聯免疫吸附分析(ELISA)，將大量不同的目標蛋白按照指定順序固定于固相載體(玻片、云母)表面，通過熒光標記抗體或相互作用分子指示靶標蛋白的位置，從而獲取相互作用的信息。蛋白芯片技術使得復雜相互作用網絡的構建和多目標分子同時檢測成為現實。傳統的蛋白芯片是通過在抗體或相互作用分子的表面修飾熒光分子來進行信號輸出，其修飾的熒光分子數量有限，過多的熒光分子修飾也會影響抗體或相互作用分子的結合能力，這限制了蛋白芯片靈敏度的提高。隨著技術的發展，常規蛋白芯片的分析靈敏度1-100ng/mL(EspinaV等，Proteinmicroarraydetectionstrategies:focusondirectdetectiontechnologies，J.Immunol.Methods.290，121–133，2004.)已經無法滿足臨床檢測和科學研究需求，亟需高靈敏的蛋白芯片檢測技術?，F有蛋白芯片的熒光檢測信號放大方法主要包括：(1)銀染增強(CN101539573、CN1743845A)，通過在特異性結合分子標記的納米金的表面進行銀離子的還原，從而使標記的納米金信號增強，是一種基于化學反應的信號擴增方法；然而，銀染增強的方法過程復雜，容易產生較強的背景信號，靈敏度提升有限。(2)量子點(MeiHu等，Ultrasensitive,MultiplexedDetectionofCancerBiomarkersDirectlyinSerumbyUsingaQuantumDot-BasedMicrofluidicProteinChip，ACSNano.2010.Jan；4(1):488-494.)，該方法利用量子點本身較好的熒光性質，將其標記在抗體等特異性結合分子上，從而提高蛋白芯片的熒光信號響應；然而，量子點修飾過程復雜，容易發生熒光淬滅，批量生產的質控困難，且成本高昂，至今未進入大規模的商業化生產。(3)碳納米管介導的拉曼增強(BeausoleilSA等，Aprobability-basedapproachforhigh-throughputproteinphosphorylationanalysisandsitelocalization，NatBiotechnol.2008.Nov；26(11):1285-92.)，通過在碳納米管的表面反復還原金和銀，形成粗糙的金屬表面，從而得到表面增強拉曼信號，用于蛋白芯片檢測的信號放大；然而，碳納米管拉曼標記的制備、標記過程復雜，需要專用的儀器，方法不通用。(4)病毒載體介導的熒光信號放大(KimE.Sapsford等，Acowpeamosaicvirusnanoscaffoldformultiplexedantibodyconjugation:Applicationasanimmunoassaytracer，BiosensBioelectron.2006,21(8):1668-1673.)，利用病毒顆粒較大的比表面積和豐富的表面反應基團，同時修飾抗體和熒光染料，通過病毒顆粒本身來結合大量的熒光分子，從而在結合目標分子時提高熒光分子的數量來達到信號放大的目的；然而，病毒載體介導的熒光信號放大方法靈敏度提升有限，且制備過程復雜，不可控。上述現有技術中，無論是通過提高標記分子的熒光強度(或通過化學反應來提高標記信號強度)還是提高標記熒光分子數量來放大蛋白芯片的信號，均存在靈敏度提升不足、制備復雜、成本高等缺陷。
技術實現思路
本專利技術為克服現有技術中免疫檢測尤其是蛋白芯片檢測靈敏度不足、制備復雜等缺點，提供一種多功能熒光蛋白納米線及其介導的免疫分析信號放大方法，以熒光分子作為信號分子，在位于多功能熒光蛋白納米線兩端的熒光分子表面修飾功能配體作為結合分子，可用于提高免疫檢測靈敏度。為了實現本專利技術的目的，本專利技術采用如下技術方案：本專利技術一方面提供一種多功能熒光蛋白納米線，包括蛋白納米線以及連接在蛋白納米線外側的熒光分子，其中，所述蛋白納米線通過成線蛋白自組裝形成，至少一個所述熒光分子表面連接功能配體，至少一個所述熒光分子表面未連接功能配體。在本專利技術一具體實施方式中，所述成線蛋白為含有能夠組裝成線性納米結構自組裝結構域的蛋白，例如可為酵母朊蛋白(Sup35)、淀粉樣蛋白Ure2、絲素蛋白等。優選的，成線蛋白為酵母朊蛋白，Sup35的第1-61位氨基酸為自組裝結構域。在本專利技術一具體實施方式中，所述熒光分子包括綠色熒光蛋白或其變體蛋白等自身在一定波長的光激發后發出熒光的蛋白質，以及熒光素酶等使底物發光的蛋白質。優選的，所述熒光分子為綠色熒光蛋白。在本專利技術一具體實施方式中，所述功能配體包括能夠直接(如具有特異性結合能力的功能化抗體、金屬結合肽、蛋白A、蛋白G等)或間接(如生物素、親和素等)與抗體或抗原等結合的化合物，能夠催化不同反應的酶分子(如甲基對硫磷水解酶MPH、辣根過氧化物酶HRP、葡萄糖氧化酶GOD或堿性磷酸酶ALP等)。優選的，所述功能配體為生物素。在本專利技術一具體實施方式中，所述成線蛋白為酵母朊蛋白，所述熒光分子為綠色熒光蛋白，所述功能配體為生物素，所述綠色熒光蛋白表面通過遺傳修飾連接生物素。具體的，所述綠色熒光蛋白表面通過遺傳修飾連接生物素包括：通過分子克隆在所述綠色熒光蛋白的C末端融合生物素接受多肽(biotinacceptedpeptide,BAP)得到融合蛋白基因，將所述融合蛋白基因克隆入表達載體；將生物素蛋白連接酶(Biotin-proteinligase,BirA)克隆入共表達載體中；將所述表達載體、共表達載體轉入表達宿主中培養，活化至對數生長期后加入誘導表白蛋白和生物素；經破碎、純化后制得生物素化的綠色熒光蛋白。在本專利技術一具體實施方式中，表面連接功能配體的熒光分子位于靠近蛋白納米線端部的位置，且其數量小于表面未連接功能配體的熒光分子的數量。在本專利技術一具體實施方式中，熒光分子為綠色熒光蛋白，功能配體為生物素，多功能熒光蛋白納米線整合了大量的熒光蛋白在其表面，而在多功能熒光蛋白納米線兩端結合有本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種多功能熒光蛋白納米線，包括蛋白納米線以及連接在蛋白納米線外側的熒光分子，其中，所述蛋白納米線通過成線蛋白自組裝形成，至少一個所述熒光分子表面連接功能配體，至少一個所述熒光分子表面未連接功能配體。

【技術特征摘要】
1.一種多功能熒光蛋白納米線，包括蛋白納米線以及連接在蛋白納米線外側
的熒光分子，其中，所述蛋白納米線通過成線蛋白自組裝形成，至少一個所述熒
光分子表面連接功能配體，至少一個所述熒光分子表面未連接功能配體。
2.如權利要求1所述的多功能熒光蛋白納米線，其特征在于：所述成線蛋白
為酵母朊蛋白，所述熒光分子為綠色熒光蛋白，所述功能配體為生物素，所述綠
色熒光蛋白表面通過遺傳修飾連接生物素。
3.如權利要求1或2所述的多功能熒光蛋白納米線，其特征在于：表面連接
功能配體的熒光分子位于靠近蛋白納米線端部的位置，且其數量小于表面未連接
功能配體的熒光分子的數量。
4.一種如權利要求1-3任一項所述的多功能熒光蛋白納米線的制備方法，包
括如下步驟：
(1)通過分子克隆將成線蛋白的自組裝結構域與熒光分子融合形成融合蛋
白基因LP-FP；
(2)通過分子克隆將成線蛋白自組裝結構域與熒光分子融合后，在熒光分
子末端連接功能配體，形成融合蛋白基因LP-L；
(3)將步驟(1)和步驟(2)得到的融合蛋白基因LP-FP及LP-L分別經
表達純化得到融合蛋白LP-FP及LP-L；
(4)將步驟(3)得到的融合蛋白LP-FP及LP-L通過自組裝形成多功能熒
光蛋白納米線。
5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述成線蛋白為酵母朊蛋白，
所述熒光分子為綠色熒光蛋白，所述功能配體為生物素，所述綠色熒光蛋白表面
通過遺傳修飾連接生物素，所述多功能熒光蛋白納米線的制備包括如下步驟：
(1)通過分子克隆將酵母朊蛋白的自組裝結構域與綠色熒光蛋白融合形成
融合蛋白基因Sup35-GFP；
(2)通過分子克隆將酵母朊蛋白的自組裝結構域與綠色熒光蛋白融合后，
在綠色熒光蛋白C端連接生物素接受多肽BAP，形成融合蛋白基因Sup35-BAP；
(3)將步驟(1)和步驟(2)得到的融合蛋白基因Sup35-GFP和Sup35-BAP

\t分別經表達純化得到融合蛋白Sup35-GFP及生物素化的Sup35-BA...

【專利技術屬性】
技術研發人員：門冬，張先恩，周娟，張治平，
申請(專利權)人：中國科學院武漢病毒研究所，
類型：發明
國別省市：湖北;42