一種HBV表面抗體時間分辨免疫熒光檢測試劑盒及其制備方法技術

本發明專利技術的一種HBV表面抗體時間分辨免疫熒光檢測試劑盒，本試劑盒采用的是時間分辨免疫熒光分析法，可有效地排除非特異性熒光的干擾，極大的提高了靈敏度；另外，本發明專利技術的包被反應板的為完全不透光的板架和相應配合的酶標板組成，每個微孔之間完全無影響，使得陰性樣本與Blank的熒光本底大大降低，信噪比顯著提高，酶標板包被采用特殊輻照，使得包被效果顯著提高，進一步地提高了試劑盒的靈敏度；同時本試劑盒包被用的HBV表面抗原采用特定方法而獲得，亦提高了表面抗原的純度及得率，使得包被和檢測效果進一步提高，使得本發明專利技術具有和進口試劑盒相似甚至更高的檢測靈敏度，但成本遠低于進口試劑盒，適合規模生產和應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及病毒蛋白免疫分析
，尤其涉及一種HBV表面抗體時間分辨免疫熒光檢測試劑盒及其制備方法。
技術介紹
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一種嗜肝病毒，是肝病毒家族的DNA逆轉錄病毒，于1965年被丹娜發現，被稱之為丹式顆粒。主要存在于肝細胞并損害肝細胞，該病原體可通過血液，母嬰和性傳播感染機體，引起肝細胞炎癥、壞死、纖維化，損害肝臟，引發乙型病毒性肝炎疾病，簡稱乙肝。乙型病毒性肝炎分急性和慢性兩種。急性乙型肝炎在成年人中90％可自愈，而慢性乙型肝炎表現不一，分為慢性乙肝攜帶者、慢性活動性乙型肝炎、乙肝肝硬化等。HBV在全世界范圍內均有流行，據WHO統計，全球約有20億人感染過HBV病毒，其中3億以上的人群為慢性HBV攜帶者，迄今為止，每年仍有近100萬人死于HBV感染引起的肝衰竭和肝癌。在我國，約有1億的HBV攜帶者，目前乙肝病毒攜帶率為7.18％，其中約三分之一有反復肝損害，表現為活動性的乙型肝炎或者肝硬化。乙肝流行范圍廣，治療困難，對人體造成的危害大。首先，乙肝的傳染性極強。乙肝病毒由質地堅硬的外殼包被，保護病毒不受外界惡劣環境侵害，使其生命力極其頑強，它可通過患者排出的各種體液傳染給健康的人群。其次，乙肝的治愈非常困難，雖然現在市面上針對乙肝治療的藥品很多，但真正治愈的特效藥品很少。此外，乙肝容易發生惡變，據統計，HBV攜帶者如果不加以治療，31.6％～60.1％將會轉化成慢性肝炎，而20.8％～56.3％的慢性肝炎會惡化變成肝硬化，肝硬化患者如不及時治療就會有16％～51.1％的患者轉化為肝癌，危及生命。乙肝還具有突發性，乙肝病毒在人體內存在，具有一定的潛伏期，不易被發現，當外界條件成熟，就可突然間發作，并且不可抑制。對HBV的防治成為全世界亟待解決的問題。在尚未找到較好的治療方法之前，對
乙肝病毒的預防就顯得尤為重要。乙肝疫苗的推廣應用，使得乙肝病毒的感染率逐年下降，對乙型肝炎的預防和控制起重要作用。乙型肝炎表面抗體是對乙肝病毒免疫的保護性抗體。它的陽性表明既往感染過乙肝病毒，但已經排除病毒，或者接種過乙肝疫苗，產生了保護性抗體。血清中乙型肝炎表面抗體滴度越高，保護力越強。乙型肝炎表面抗體是由乙型肝炎表面抗原誘導產生，為保護性抗體。在HBV感染恢復期或注射乙肝疫苗后出現，它的出現標志對HBV感染產生特異性免疫。乙型肝炎表面抗體是指動物或人體抗乙型肝炎表面抗原產生的IgG、IgM等類型抗體的總稱，廣泛應用于乙型肝炎病毒鑒定、乙型肝炎疫苗以及乙型肝炎表面抗原的定性和定量檢測中。近年來臨床上應用較多的乙型肝炎病毒表面抗體免疫檢測方法主要有放射免疫測定(Radioimmunoassay，RIA)、酶聯免疫分析法(Enzyme Immunoassay，EIA)、化學發光免疫分析法(Chemilumineseent Immunoassay，CLIA)和時間分辨免疫熒光分析法(Time-resolved Immunofluorometric Assay，TRIFMA)。RIA臨床應用較早，敏感性高，特異性好，結果可用儀器定量檢測。EIA推廣應用稍晚于RIA，其優點在于其無污染、操作簡單、試劑有效期長、特異性好以及結果可用儀器測定等特點。CLIA的優點在于其靈敏度高、線性范圍廣、便于實現自動化、產品有效期長、對環境無污染、對人體無毒無害等優點。RIA存在核輻射危害、有效期短、操作復雜、測定時間長和難于實現自動化等缺點。EIA敏感性相對較低，測定范圍相對較窄等缺點，主要用于定性檢測，限制了其在微量免疫定量分析中的應用。由于大多數板式CLIA試劑盒仍采用EIA相同的酶促反應，以辣根酶或堿性磷酸酶交聯抗體，使用魯米諾或金剛烷等作為底物，檢測的是動態發光，導致檢測信號值衰減較快、高濃度和低濃度信號衰減速度不一致，限制了其在免疫定量分析中的低端檢測靈敏度、穩定性和重復性。TRIFMA靈敏度相對較高，特異性好，但是國內應用TRIFMA法的試劑盒與和進口試劑盒相比，普遍存在靈敏度不夠的問題。
技術實現思路
本專利技術為解決現有技術中的上述問題提出的一種兼具操作簡單、靈敏度高、
特異性好、無污染特點，又能夠以較低成本具備和進口發光試劑相似的檢測靈敏度的HBV表面抗體時間分辨免疫熒光檢測試劑盒及其制備方法。為了實現上述技術目的，本專利技術所采取的技術措施為：一種HBV表面抗體時間分辨免疫熒光檢測試劑盒，包括包被反應板，還包括乙型肝炎表面抗體校準品、鑭系元素離子標記的HBV表面抗原，所述包被反應板包括相互配合的板架和酶標板，所述板架設有多個與酶標板配合的通孔，所述酶標板吸附有HBV表面抗原。為了進一步優化上述技術方案，本專利技術所采取的技術措施還包括：優選地，上述的板架為完全不透光的材料制作，所述酶標板為經鈷60輻照30天后，HBV表面抗原使用緩沖液稀釋至1-5μg/mL后加入微孔反應板內，以100μL/孔包被過夜，然后經洗滌、封閉、干燥而獲得，其中HBV表面抗原為用鹽析離心法與疏水層析法相結合而獲得；具體地，所述HBV表面抗原的具體制備方法為將重組抗原溶液按體積加10％硫酸銨沉淀，經0.65um濾芯除去細胞碎片后，經層析柱分離獲得洗脫峰，洗脫峰經溴化鉀等密度梯度超速離心(1.04g/ml-1.34g/ml)，30000r/min離心24h，用高比重頂液頂出，分部收集，將收集的液體經凝膠過濾層析，得到高純度的HBV表面抗原。所述酶標板是經過鈷60射線輻照后，微孔表面發生了氧化，產生了某些含氧的活性基團改善了對包被生物分子的親水性與化學反應性能，從而在不改變檢測的特異性但可明顯提高檢測的敏感性和均一性。進一步地，上述的板架的高度和酶標板完全匹配，使得板架和酶標板組合后，不同微孔之間完全沒有光線的相互干擾，板架的高度優選為1-1.5cm，板架上的通孔的邊緣的相互距離為0.6-1.2mm。進一步地，本專利技術的試劑盒還包括緩沖液、洗滌液、熒光增強液。優選地，所述鑭系元素離子為Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+中的至少一種，更優選為Eu3+。進一步地，本專利技術的熒光增強液含有β-二酮類化合物或芳香胺類化合物。另一方面，本專利技術還提供制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟：步驟1制備預處理包被反應板：使用黑色聚苯乙烯制備板架，預留與酶標板相互配合的通孔；酶標板經過鈷
60輻照30天后，與板架配合組裝，獲得預處理包被反應板，備用；步驟2包被HBV表面抗原反應板的獲得：用鹽析離心法與疏水層析法相結合獲得HBV表面抗原，使用鹽析離心法與疏水層析法相結合制備抗原具有無可比擬的優勢。鹽析離心法收率高,但由于大量使用長時間的超速離心,純化周期較長,由于超速離心機轉頭壽命有限,費用較高；疏水層析法純度高，但收率較低，本專利技術在制備HBV表面抗原時，結合2種方法的優點，大大提高了表面抗原的純度及得率。將獲得的表面抗原使用緩沖液稀釋至1-5μg/mL后加入步驟1獲得的預處理包被反應板的酶標板微孔內，以100μL/孔包被過夜，然后經洗滌、封閉、干燥，將微孔板條真空密封于鋁箔袋內，冷藏備用；步驟3鑭系元素離子標記的HBV表面抗原的獲得：將另一種具有和包被抗原所不同的抗原表位的HBV表面抗本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種HBV表面抗體時間分辨免疫熒光檢測試劑盒，包括包被反應板，其特征在于，還包括乙型肝炎表面抗體校準品、鑭系元素離子標記的HBV表面抗原，所述包被反應板包括相互配合的板架和酶標板，所述板架設有多個與酶標板配合的通孔，所述酶標板吸附有HBV表面抗原。

【技術特征摘要】
1.一種HBV表面抗體時間分辨免疫熒光檢測試劑盒，包括包被反應板，其特征在于，還包括乙型肝炎表面抗體校準品、鑭系元素離子標記的HBV表面抗原，所述包被反應板包括相互配合的板架和酶標板，所述板架設有多個與酶標板配合的通孔，所述酶標板吸附有HBV表面抗原。2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的板架為完全不透光的材料制作，所述酶標板為經鈷60輻照30天后，HBV表面抗原使用緩沖液稀釋至1-5μg/mL后加入微孔反應板內，以100μL/孔包被過夜，然后經洗滌、封閉、干燥而獲得，其中HBV表面抗原為用鹽析離心法與疏水層析法相結合而獲得。3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述HBV表面抗原的具體制備方法為將HBV重組抗原溶液按體積加10％硫酸銨沉淀，經0.65um濾芯除去細胞碎片后，經層析柱分離獲得洗脫峰，洗脫峰經溴化鉀等密度梯度30000r/min超速離心24h，用高比重頂液頂出，分部收集，將收集的液體經凝膠過濾層析，得到高純度的HBV表面抗原。4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括緩沖液、洗滌液、熒光增強液。5.根據權利要求1-4任意一項所述的試劑盒，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+中的至少一種。6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+。7.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光增強液含有β-二酮類化合物或芳香胺類化合物。8.一種制備如權利要求1所述的試...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李楠，黃加喜，于春紅，
申請(專利權)人：蘇州新波生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32