晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法：利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞；運用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片；進(jìn)而通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的ER表達(dá)情況。借助于ISET技術(shù)分離富集CTCs，依靠細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定CTCs，克服了單純ISET技術(shù)鑒定CTCs存在的困難和單純免疫學(xué)檢測技術(shù)存在的假陰性。該技術(shù)設(shè)備要求不高，方法易掌握，并能實時監(jiān)測。通過該技術(shù)方法，不用取材乳腺癌組織即可檢測到晚期乳腺癌患者ER表達(dá)情況。

Detection of ER gene in peripheral blood circulating tumor cells in patients with advanced breast cancer

The invention discloses a detection method for patients with advanced breast cancer circulating tumor cells in peripheral blood of ER gene: by using membrane filtration and separation device for patients with advanced breast cancer in peripheral blood CTC cells; using immunofluorescence techniques to identify patients with advanced breast cancer circulating tumor cells; using cell block fabrication technology of thin layer and then through the section; circulating tumor cells in blood ER immunohistochemical technique in patients with advanced breast cancer peripheral expression. With the help of ISET technology, CTCs was separated and enriched, and CTCs was identified by immunofluorescence technique, which overcame the difficulty of identifying CTCs by using ISET alone and the false negative result of pure immunological detection. The technical equipment requirements are not high, the method is easy to grasp, and real-time monitoring. By using this method, the expression of ER in the patients with advanced breast cancer can be detected without breast cancer.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種檢測ER基因的新方法，尤其是通過外周血檢測晚期乳腺癌患者ER基因的方法。
技術(shù)介紹
目前作為預(yù)后因子納入治療指南中的雌激素受體(Estrogenreceptor，ER)已經(jīng)成為制定乳腺癌患者內(nèi)分泌治療方案時最重要的指標(biāo)。現(xiàn)有的乳腺癌ER的檢測需要通過手術(shù)或穿刺活檢等方式獲得原發(fā)瘤或轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤組織標(biāo)本，然而不是每一位患者都能獲得腫瘤組織樣本，而且不能在治療過程中進(jìn)行連續(xù)的檢測，限制了其成為有效的療效監(jiān)測指標(biāo)。但脫落入血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以給我們提供潛在的實時腫瘤標(biāo)本，其突變狀態(tài)同樣可以用于指導(dǎo)治療。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulatingtumorcell，CTC)是從實體腫瘤脫落而進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，它存在于乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預(yù)后以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測具有微創(chuàng)、實時等特點，被稱為“液態(tài)活檢”。目前CTCs檢測的主要方法包括依賴腫瘤相關(guān)標(biāo)志物檢測的免疫學(xué)檢測技術(shù)及基于形態(tài)學(xué)富集的膜過濾技術(shù)(Isolatingbysizeofepithelialtumorcells，ISET)。前者是基于細(xì)胞表面表達(dá)不同抗原標(biāo)志，將針對腫瘤細(xì)胞表面抗原的特異性抗體EpCAM、CK等包被于磁珠表面以完成腫瘤細(xì)胞的特異性識別，借助外加磁場篩選富集CTCs。該技術(shù)的優(yōu)勢在于特異度較高，已有商品化的半自動檢測設(shè)備(CellSearch)；但腫瘤特異性抗原表達(dá)的缺失會造成假陰性結(jié)果。后者是根據(jù)細(xì)胞大小的差異，利用過濾的方法將體積較大的腫瘤細(xì)胞篩選富集。該技術(shù)的優(yōu)勢在于方法簡單、價格低廉，分離獲得的CTCs具有活性可用于后續(xù)研究；但由于缺乏形態(tài)學(xué)診斷金標(biāo)準(zhǔn)，該富集技術(shù)特異性相對較差。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了克服傳統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)及晚期乳腺癌患者不適宜組織標(biāo)本取材--進(jìn)而無法評估患者ER狀態(tài)的不足，本專利技術(shù)專利提供一種晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法：利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞；運用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片；進(jìn)而通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的ER表達(dá)情況。該方法具體步驟如下：一、利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：1、采集晚期乳腺癌癥患者外周血：肘正中靜脈10ml，均分為2管編寫相同編號后，分別命名為實驗1組和實驗2組；2、將2管外周血樣分別進(jìn)行預(yù)處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：1mmol/lEDTA+0.1％BSA,稀釋后用4％多聚甲醛固定外周血樣10分鐘；3、利用膜過濾裝置分離外周血樣，富集外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：將預(yù)處理的外周血樣加入到膜過濾裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；4、過濾結(jié)束后，從膜過濾裝置中取下濾器，PBS沖洗2-3次，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞被截留在濾膜上。二、利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：1、向?qū)嶒?組分離獲取外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的濾器中加入Cytoperm/Cytofix試劑300μl，固定、穿孔15min；2、PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后加入washbuffer300μl，封閉30min；3、加入CK8/18/19、CD45一抗混懸液300μl，兩種一抗均以washbuffer稀釋，混勻后的終濃度為1:250，室溫下孵育45min；4、Washbuffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入二抗混懸液300μl，兩種二抗均以washbuffer稀釋，混勻后的終濃度為1:500，室溫下避光孵育30min；5、Washbuffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入Hoechst300μl，洗染細(xì)胞核5min；6、PBS漂洗2次，每次3分鐘，之后取出濾膜置于載玻片上，滴加10μl抗熒光淬滅封閉液封片；7、熒光顯微鏡下2h內(nèi)觀察結(jié)果，拍照、記錄CTC情況，確定是否存在CTC；如觀察到CTC則繼續(xù)進(jìn)行下一步檢測，否則停止檢測。三、運用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作CTC細(xì)胞蠟塊：1、從過濾裝置中取下實驗2組相同血樣編號的濾器，打開并移走濾器上口，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞染色液加入到濾器中，染色2min，PBS緩沖液沖洗干凈，用眼科鑷子取下濾膜，放置在載玻片上，適當(dāng)干燥后在顯微鏡下觀察,證實存在CTC；2、制作CTC細(xì)胞蠟塊；A、脫色：將上述載玻片上的濾膜取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液，所述脫色液為：95％酒精與100％二甲苯按體積比1:1混勻；B、包裹：浸泡結(jié)束后取出濾膜，用吸水紙包裹；C、固定：將包裹物置于10％中性福爾馬林中，固定4-6h。D、浸蠟包埋：固定結(jié)束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細(xì)胞石蠟塊。E、薄層切片：用切片機(jī)將細(xì)胞石蠟塊連續(xù)切片，制成厚度為2-4μm的薄層切片。四、通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的ER表達(dá)情況：1.烤片：CTC蠟塊薄層切片在60℃恒溫箱中烤片2小時；2.脫蠟：切片于兩瓶二甲苯中分別放置5分鐘；3.水化：將切片依次在無水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分別放置1分鐘(視室內(nèi)溫度情況稍作調(diào)整)：自來水、蒸餾水沖洗；4.抗原修復(fù)：將高壓鍋內(nèi)的修復(fù)液EDTA煮沸，放入切片至完全沒入修復(fù)液蓋上高壓鍋蓋及壓力閥，加熱至高壓鍋噴氣后1.5分鐘，離火，將高壓鍋稍冷卻打開鍋蓋，切片在修復(fù)液中自然冷卻；5.蒸餾水沖洗；6.去除內(nèi)源性過氧化物酶：用3％H2O2作用切片10分鐘；7.蒸餾水沖洗；8.PBS浸洗5次各1.5分鐘；9.滴加ER一抗，4℃冰箱中過夜，然后將其放入PBS浸洗5次，每次浸洗1.5分鐘；10.滴加二抗；11.37℃水浴鍋中孵育20分鐘；12.PBS浸洗5次各1.5分鐘；13.顯微鏡下控制，DAB顯色；14.自來水沖洗，蘇木精染液復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)；15.自來水沖洗5分鐘；16.75％-95％-100％梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片；17.細(xì)胞病理學(xué)專家閱片，判讀ER表達(dá)情況。利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞步驟中所述的膜過濾裝置：包括濾器、血樣容器、廢液缸和鐵架臺，所述鐵架臺設(shè)有底座、立架和支架，所述血樣本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法，其特征在于，利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞；運用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片；進(jìn)而檢測晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的ER表達(dá)情況。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢測方法，其特征在
于，利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；鑒定晚期
乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞；運用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片；進(jìn)而
檢測晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的ER表達(dá)情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢
測方法，其特征在于，所述的膜過濾裝置包括濾器(3)、血樣容器(2)、
廢液缸(5)和鐵架臺(1)，所述鐵架臺(1)設(shè)有底座(11)、立架(12)
和支架(13)，所述血樣容器(2)通過支架(13)設(shè)置于鐵架臺(1)上
部，血樣容器(2)的下方為濾器(3)，濾器(3)通過輸液器(4)聯(lián)通
至廢液缸(5)，廢液缸(5)設(shè)置于底座(11)上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢
測方法，其特征在于：所述濾器(3)包括濾器上口(6)、濾膜(7)、載
濾膜平臺(8)和濾器下口(9)，濾膜(7)置于載濾膜平臺8上；濾器上
口(6)接血樣容器(2)，濾器下口(9)通過輸液器(4)接廢液缸(5)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢
測方法，其特征在于：所述濾膜(7)為疏水材料制成，其上均勻布滿口
徑為10微米的濾孔(10)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢
測方法，其特征在于，所述的利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外
周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，步驟如下：
1)采集晚期乳腺癌癥患者外周血：肘正中靜脈5ml；
2)將外周血樣進(jìn)行預(yù)處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液

\t成分：1mmol/lEDTA+0.1％BSA，稀釋后用4％多聚甲醛固定外周血樣10
分鐘；
3)利用膜過濾裝置分離外周血樣，富集外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：將預(yù)
處理的外周血樣加入到膜過濾裝置的血樣容器(2)中，使其依靠重力自
然過濾；
4)過濾結(jié)束后，從膜過濾裝置中取下濾器(3)，PBS沖洗2-3次，
外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞被截留在濾膜(7)上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞ER基因的檢
測方法，其特征在于，所述的鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，
步驟如下：
1)向分離獲取外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的濾器(3)中加入
Cytoperm/Cytofix試劑300μl，固定、穿孔15min；
2)PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后加入washbuffer300μl，封
閉30min；
3)加入CK8/18/19、CD45一抗混懸液300μl，三種一抗均以wash
buffer稀釋，混勻后的終濃度為1:250，室溫下孵育45min；
4)Washbuffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入二抗混懸液300
μl，三種二抗均以w...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫萍，戴亮，李勝，王振丹，
申請(專利權(quán))人：山東省藥物研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37