本發(fā)明專利技術(shù)提出了一種反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液及其一種制備cDNA的方法。本發(fā)明專利技術(shù)所提出的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和利用該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液制備cDNA的方法，具有操作簡便、反應(yīng)快速、反應(yīng)效果好、可重復(fù)性高的優(yōu)點。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物
，具體的，本專利技術(shù)涉及一種反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液及一種制備cDNA的方法。
技術(shù)介紹
基因表達與調(diào)控的分析與檢測是現(xiàn)代分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的重要課題。近年來隨著基因表達調(diào)控分析檢測技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)的檢測技術(shù)也越來越多，比如：原位雜交、Northern雜交、RNA酶保護實驗、基因芯片分析、實時定量PCR分析以及反轉(zhuǎn)錄PCR分析(RT-PCR)等。其中的RT-PCR分析由于操作簡單，檢測mRNA水平靈敏，被認為是檢測基因表達的主要手段之一。RT-PCR是一種將反轉(zhuǎn)錄(ReverseTranscription；RT)反應(yīng)和PCR(PolymeraseChainReaction)反應(yīng)組合在一起的檢測技術(shù)。其中的RT(反轉(zhuǎn)錄)反應(yīng)是RT-PCR技術(shù)的關(guān)鍵，它是以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成與模板mRNA互補的DNA即cDNA的過程。cDNA的合成和克隆技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)今分子生物學(xué)研究的重要手段。合成cDNA第一鏈的方法離不開依賴RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)的作用。目前非常常用且已經(jīng)商品化的反轉(zhuǎn)錄酶有禽類成髓細胞病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶和鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶這兩種。通常情況下，RT反應(yīng)過程由3個步驟組成：首先通過高溫將RNA模板的二級結(jié)構(gòu)打開；其次通過反轉(zhuǎn)錄酶催化反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；最后通過高溫對反轉(zhuǎn)錄酶進行滅活，以保證后續(xù)PCR過程的順利進行。然而，如何進一步提高cDNA的合成效率仍有待進一步開發(fā)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。本專利技術(shù)是基于專利技術(shù)人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：反轉(zhuǎn)錄常規(guī)的操作流程需要3個不同的反應(yīng)溫度，且反應(yīng)體系配制過程復(fù)雜，容易出錯，另外，整個操作過程需要近2個小時的操作和反應(yīng)時間，耗時費力。所以，常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，不但會給實驗操作者帶來不便，而且越來越不能滿足基因分析的高速、高通量的需求。目前一些商品化試劑盒中不乏反應(yīng)快速和操作簡便的產(chǎn)品，但是反應(yīng)效果一般，重復(fù)性不好，很難得到推廣。基于上述問題，在本專利技術(shù)中，專利技術(shù)人提出了一種操作簡便，反應(yīng)快速的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，以此反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液對RNA樣品進行反轉(zhuǎn)錄處理所需時間僅為15分鐘，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效果佳，重復(fù)性好。在本專利技術(shù)的第一方面，本專利技術(shù)提出了一種反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括：0.1～0.3摩爾/升三羥甲基氨基甲烷；30～50毫摩爾/升硫酸銨；6～10毫摩爾/升氯化鎂；0.2～0.4摩爾/升氯化鈉；2～4毫摩爾/升二硫蘇糖醇；100～300毫摩爾/升海藻糖；0.001％～0.005％(質(zhì)量體積比)明膠；1～3毫摩爾/升的乙二醇雙四乙酸；脫氧核苷三磷酸各1～3毫摩爾/升；5～20微摩爾/升的Oligo-dT15引物；10～30微摩爾/升的隨機引物；25～75個單位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶；1.5～2.1個單位/微升的RNA酶抑制劑；0.5％～1％(體積比)甘油；以及余量的水。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，利用本專利技術(shù)所提出的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作簡便、反應(yīng)快速、反應(yīng)效果好、可重復(fù)性高。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液還可以具有下列附加技術(shù)特征之一：根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的pH為8.0～8.8。pH為8.0～8.8時，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA時活性高、效率高。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，優(yōu)選反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的pH為8.3，最大限度的發(fā)揮了MMLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA的活性，因此，利用本專利技術(shù)實施例的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)速度進一步提高、反應(yīng)效果和可重復(fù)性進一步提高。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，所述氯化鈉的用量是0.3摩爾/升，所述硫酸銨的用量是40毫摩爾/升，所述二硫蘇糖醇的用量是3毫摩爾/升，所述乙二醇雙四乙酸的用量是1.6毫摩爾/升，所述明膠的用量是0.002％(質(zhì)量體積比)，所述甘油的用量是1％(體積比)。在上述氯化鈉、硫酸銨、二硫蘇糖醇、乙二醇雙四乙酸、明膠和甘油的用量下，利用本專利技術(shù)實施例的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)速度、反應(yīng)效果和可重復(fù)性的到更進一步顯著提高。在本專利技術(shù)的第二方面，本專利技術(shù)提出了前面所述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液在RNA樣本的反轉(zhuǎn)錄處理中的用途。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，利用本專利技術(shù)所提出的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作簡便、反應(yīng)快速、反應(yīng)效果好、可重復(fù)性高。在本專利技術(shù)的第三方面，本專利技術(shù)提出了一種制備cDNA的方法。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，包括：利用前面所述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液對RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄處理，以便獲得所述cDNA。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，本專利技術(shù)提出的制備cDNA的方法具有和本專利技術(shù)提出的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液相同的效果和優(yōu)點，即本專利技術(shù)提出的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)快速、效果好、可重復(fù)性高。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，上述制備cDNA的方法還可以具有下列附加技術(shù)特征之一：根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，所述反轉(zhuǎn)錄處理是在42攝氏度的條件下進行15分鐘。常規(guī)反轉(zhuǎn)錄處理所需時間是60～65分鐘，本專利技術(shù)所提出的制備cDNA的方法是15分鐘，反應(yīng)快速。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，所述反轉(zhuǎn)錄處理進一步包括：(1)將所述RNA樣品、水和所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液混合，以便獲得反應(yīng)混合物，其中，基于50納克～2微克的所述RNA樣本，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的用量為5微升，所述水的用量用于將所述反應(yīng)混合物的體積調(diào)劑至20微升；以及(2)將步驟(1)所得反應(yīng)混合液進行所述反轉(zhuǎn)錄處理，以便獲得所述cDNA。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，本專利技術(shù)所提出的制備cDNA的方法具有反應(yīng)快速、反應(yīng)效果好、可重復(fù)性高的特點。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，所述水是去離子水。去離子水可防止RNase對RNA的降解、防止水中離子對反應(yīng)體系的干擾以及避免非特異性產(chǎn)物的生成。因此，反轉(zhuǎn)錄處理過程中使用去離子水進一步提高了本專利技術(shù)提出的制備cDNA方法的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。根據(jù)本專利技術(shù)的實施例，所述混合是在4攝氏度下進行的。在4攝氏度下進行混合處理，保證了RNA樣品的穩(wěn)定和反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄酶的穩(wěn)定。因此，混合處理在4攝氏度下進行保證了本專利技術(shù)所提出的制備cDNA的方法的穩(wěn)定性和可靠性進一步提高。附圖說明圖1是根據(jù)本專利技術(shù)實施例1的通過本專利技術(shù)提出的制備cDNA的方法制備的cDNA進行熒光定量PCR的檢測圖；圖2是根據(jù)本專利技術(shù)實施例1的通過常規(guī)反轉(zhuǎn)錄方法制備的cDNA進行熒光定量PCR的檢測圖；以及圖3是根據(jù)本專利技術(shù)實施例2的通過本專利技術(shù)提出的制備cDNA的方法和常規(guī)反轉(zhuǎn)錄方法<本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其特征在于，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括：0.1～0.3摩爾/升三羥甲基氨基甲烷；30～50毫摩爾/升硫酸銨；6毫摩爾/升～10毫摩爾/升氯化鎂；0.2～0.4摩爾/升氯化鈉；2～4毫摩爾/升二硫蘇糖醇；100～300毫摩爾/升海藻糖；質(zhì)量體積百分數(shù)為0.001％～0.005％的明膠；1～3毫摩爾/升的乙二醇雙四乙酸；脫氧核苷三磷酸各1～3毫摩爾/升；5～20微摩爾/升的Oligo?dT15引物；10～30微摩爾/升的隨機引物；25～75個單位/微升的鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶；1.5～2.1個單位/微升的RNA酶抑制劑；0.5體積％～1體積％甘油；以及余量的水。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其特征在于，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括：
0.1～0.3摩爾/升三羥甲基氨基甲烷；
30～50毫摩爾/升硫酸銨；
6毫摩爾/升～10毫摩爾/升氯化鎂；
0.2～0.4摩爾/升氯化鈉；
2～4毫摩爾/升二硫蘇糖醇；
100～300毫摩爾/升海藻糖；
質(zhì)量體積百分數(shù)為0.001％～0.005％的明膠；
1～3毫摩爾/升的乙二醇雙四乙酸；
脫氧核苷三磷酸各1～3毫摩爾/升；
5～20微摩爾/升的Oligo-dT15引物；
10～30微摩爾/升的隨機引物；
25～75個單位/微升的鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶；
1.5～2.1個單位/微升的RNA酶抑制劑；
0.5體積％～1體積％甘油；以及
余量的水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其特征在于，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的pH為8.0～
8.8，優(yōu)選的pH為8.3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其特征在于，所述氯化鈉的用量是0.3毫摩
爾/升，所述硫酸銨的用量是40毫摩爾/升，所述二硫蘇糖醇的用量是3毫摩爾/升，所述乙
二醇雙四乙酸的...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張雙宇，劉玉方，李曉晨，孫克非，
申請(專利權(quán))人：天根生化科技北京有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11
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