一種提取川貝母DNA的方法技術

本發明專利技術提供了一種提取川貝母品DNA的方法，旨在提供一種專屬性強、富集效率高、操作相對簡單的方法，該方法依次包括下述步驟：1)前處理樣品；2)取前處理好的樣品，加入400μL裂解緩沖液和已融化的核糖核酸酶A5μL，振蕩混勻；置于70℃金屬浴中10?30分鐘，期間取出振蕩混勻數次；5000轉離心10分鐘，取上清進行提取；取出試劑盒中96位深孔板，于A行分別加入已裂解樣品300μL，連接緩沖液600μL，磁珠60μL；F行加入清洗緩沖液Ⅰ500μL；G行加入清洗緩沖液Ⅱ550μL；H行加入清洗緩沖液Ⅲ550μL；取出試劑盒中洗脫條，加入洗脫緩沖液100μL；將混合后的96位深孔板和洗脫條，置于核酸提取儀，進行DNA提取；屬于化學檢測技術領域。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術提供一種提取川貝母的DNA的方法，具體的說，是一種提取川貝母DNA的方法；屬于化學檢測

技術介紹
川貝母主要分布于四川、云南、西藏等地，品質較優，為百合科植物川貝母、棱砂、烏花等的鱗莖，具有清熱潤肺、化痰止咳的功效，藥用價值較高。傳統的川貝母的鑒別，主要是性狀、顯微鑒別、光譜法，由于市場上貝母類藥材品種較多，相同品種間也會因為藥源植物來源不一、種植環境、產地和加工等因素存在相當的混雜度,這就使得實驗人員必須具備較高的藥材鑒別經驗。隨著分子生物學技術的發展，使得中藥材的分子遺傳標記鑒別成為可能。目前文獻上已有聚合酶鏈式反應(PCR)法鑒別川貝母藥材的相關報道。《中國藥典》2015版已對川貝母引入了聚合酶鏈式反應-限制性內切酶長度多態性鑒別方法，但常規PCR存在需結合電泳分析、無法對擴增反應進行實時檢測，以及EB試劑有毒害性等缺點。
技術實現思路
針對上述不足，本專利技術的目的是提供一種通過磁珠法提取川貝母中的DNA，該提取方法專屬性強、富集效率高、操作相對簡單。一種提取川貝母品DNA的方法，依次包括下述步驟：1)前處理樣品取1g試樣，用研缽研成粉末，再精密稱取20mg至2ml滅菌離心管中；2)DNA的提取樣品的裂解：取前處理好的樣品，加入400μL裂解緩沖液和已融化的核糖核酸酶A5μL，振蕩混勻；置于70℃金屬浴中10-30分鐘，期間取出振蕩混勻數次；5000轉離心10分鐘，取上清進行提取；取出試劑盒中96位深孔板，于A行分別加入已裂解樣品300μL，連接緩沖液600μL，磁珠60μL；F行加入清洗緩沖液Ⅰ500μL；G行加入清洗緩沖液Ⅱ550μL；H行加入清洗緩沖液Ⅲ550μL；取出試劑盒中洗脫條，加入洗脫緩沖液100μL；將混合后的96位深孔板和洗脫條，置于核酸提取儀，進行DNA提取。與現有技術相比，由于傳統的DNA提取多以試劑法提取，常因步驟多，往往提取效率不高，以影響結果準確性；本專利技術采用磁珠法進行DNA提取，具有專屬性強、富集效率高、操作相對簡單等特點。具體實施方式下面結合具體實施方式，對本專利技術的權利要求做進一步的詳細說明，但不構成對本專利技術的任何限制，任何在本專利技術權利要求保護范圍所做的有限次的修改，仍在本專利技術的權利要求保護范圍之內。實施例11.材料與儀器1.1藥材1.1.1川貝母對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121000-200405)川貝母1、2來源于安徽亳州中藥材市場，川貝母3、4和5、平貝母、浙貝母和土貝母來源于廣西玉林中藥材市場，并經過形態學鑒定確認。1.1.2試劑和引物磁珠法植物DNA提取試劑盒(美國熱電公司，批號:00LSKFR804096F25N009)，SuperReal熒光定量預混試劑增強版(天根生化科技有限公司，批號：03120)，川貝母引物(invitrogen公司，批號：NSO_2954885，序列為：5’CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3’和5’GCTACGTTCTTCATCGAT3’)。所述的引物每管加超純水0.29ml進行稀釋，并渦旋振蕩混勻使其充分溶解，于-20℃冰箱保存備用。本專利技術所涉及到的百分濃度，沒有特別說明的，液體均為體積濃度，溶質為固體的指質量濃度。1.2儀器XA205DU電子天平(德國梅特勒托利多公司)、Minispin臺式高速離心機(德國Eppendorf)、MINIB-100F恒溫金屬浴(杭州米歐儀器有限公司)、LightCycler96熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)、ThermoFisherDuo核酸提取儀(美國熱電公司)。2.1樣品的前處理取1g試樣，用研缽研成粉末，再精密稱取20mg至2ml滅菌離心管中。2.2DNA的提取2.2.1樣品的裂解：取前處理好的樣品，加入400μLLysisBuffer和已融化的RNaseA5μL，振蕩混勻。置于70℃金屬浴中10-30分鐘，期間取出振蕩混勻數次。5000轉離心10分鐘，取上清進行提取。2.2.2磁珠法提取樣品DNA：取出試劑盒中96位深孔板，于A行分別加入已裂解樣品300μL，BindingBuffer600μL，磁珠60μL；F行加入清洗緩沖液Ⅰ500μL；G行加入清洗緩沖液Ⅱ550μL；H行加入清洗緩沖液Ⅲ550μL。取出試劑盒中洗脫條，加入洗脫緩沖液100μL。將混合后的96位深孔板和洗脫條，置于核酸提取儀，進行DNA提取。為了證明本專利技術提取的物質，本專利技術還提供了該引物的檢測方法：PCR反應液的配制每管PCR管中分別加入2xSuperRealPreMixPlus(withSYBRGreenI)10μL、正、反引物各0.5μL及RNase-FreeddH2O7μL。PCR往上述含有反應液的PCR管中加入2μL提取好的DNA，輕輕敲打PCR管盒，使反應液與DNA混勻，并經3000轉離心3～10秒，立即進行PCR反應。熒光定量PCR儀設置方法設置：檢測模式為熒光通道，反應總體積為20μL，染色選擇SYBRGreenI，依次選擇“Preincubation”(預變性)和“3StepAmplification”(三步擴增)，選擇Single收集熒光。qPCR反應參數按表1設置：表1qPCR反應參數設置數據處理將數據同步至電腦上，選擇“定性檢測”對試樣進行分析。結果結果見表2，其中川貝母對照藥材、川貝母1、2、3、4、5和陽性對照Cq值均<30，且擴增曲線有明顯指數增長期，故可判定為陽性；而其它貝母類和陰性對照均無Cq值，且曲線均為一條直線，故為陰性。經過多次重復測試，樣品結果穩定一致，表明該方法對川貝母的鑒別準確率高、專屬性強。樣品的qPCR結果本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種提取川貝母品DNA的方法，其特征在于，依次包括下述步驟：1)前處理樣品取1g試樣，用研缽研成粉末，再精密稱取20mg至2ml滅菌離心管中；2)DNA的提取取前處理好的樣品，加入400μL裂解緩沖液和已融化的核糖核酸酶A?5μL，振蕩混勻；置于70℃金屬浴中10?30分鐘，期間取出振蕩混勻數次；5000轉離心10分鐘，取上清進行提取；取出試劑盒中96位深孔板，于A行分別加入已裂解樣品300μL，連接緩沖液600μL，磁珠60μL；F行加入清洗緩沖液Ⅰ?500μL；G行加入清洗緩沖液Ⅱ?550μL；H行加入清洗緩沖液Ⅲ?550μL；取出試劑盒中洗脫條，加入洗脫緩沖液100μL；將混合后的96位深孔板和洗脫條，置于核酸提取儀，進行DNA提取。

【技術特征摘要】
1.一種提取川貝母品DNA的方法，其特征在于，依次包括下
述步驟：
1)前處理樣品
取1g試樣，用研缽研成粉末，再精密稱取20mg至2ml滅菌離
心管中；
2)DNA的提取
取前處理好的樣品，加入400μL裂解緩沖液和已融化的核糖核
酸酶A5μL，振蕩混勻；置于70℃金屬浴中10-30分鐘，期間取
出振蕩混勻數次；5000轉離心...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳學松，羅達龍，黃林杰，黃琳，
申請(專利權)人：廣西壯族自治區梧州食品藥品檢驗所，
類型：發明
國別省市：廣西;45