一種DNA高通量測序建庫方法技術

本發明專利技術提供了一種適用于復雜環境中生物DNA的高通量測序建庫方法，包括以下步驟：(1)對待測生物的基因組DNA進行片段化處理，獲得DNA片段化物料；(2)對所述DNA片段化物料進行瓊脂糖凝膠電泳獲得電泳膠塊，切取所述電泳膠塊中文庫目的大小的片段至比所述文庫目的大小的片段大40-60bp的片段范圍內的凝膠，回收凝膠內的DNA獲得第一純化DNA；(3)對所述第一純化DNA進行末端修復，3`末端加A，連接接頭序列獲得連接產物，并對連接產物進行Solexa?PCR擴增，獲得文庫。本發明專利技術方法操作簡單，能夠解決復雜環境中生物DNA(如：海帶DNA、貝類DNA、石榴DNA等)建庫困難的問題，且能夠降低接頭使用量，為高通量測序提供一種疑難樣品的建庫方案。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及基因高通量測序
，具體地，涉及一種適用于復雜環境中生物的DNA高通量測序建庫方法。
技術介紹
在二代和三代測序技術中，構建高質量的測序文庫是高通量測序的關鍵因素。測序文庫的質量直接決定測序產出的數據質量，進而對數據分析有著莫大的關聯。隨著高通量測序技術的快速發展，各大試劑公司，包括Illumina、NEB、KAPA、Nugen等，已能提供多種文庫制備的試劑或試劑盒，為DNA、RNA等形式的核酸樣品的建庫帶來極大的便利，但是，在DNA核酸建庫方面，并不是所有物種的DNA都能夠順利完成文庫的構建。究其原因為這些DNA樣品中含有大量雜質，特性與DNA相近，不能夠通過調整DNA提取條件去除干凈，且這些雜質對建庫過程中酶反應產生抑制效應，使DNA修復不完全或接頭連接效率低，最終導致文庫產出量低。比較有代表性的一種生物類型是海洋生物，如海帶、貝類等。利用上述各大公司提供的建庫方法，海帶、貝類DNA仍然不能得到有效的文庫產出，因此迫切需要一種能夠有效降低復雜環境中生物DNA雜質污染的影響，特別是降低海洋生物DNA中雜質污染的影響的建庫方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于解決現有的高通量測序建庫方法中難以降低環境中雜質污染的影響的問題，提供一種能夠有效避免環境雜質污染的DNA高通量測序建庫方法。為達到以上目的，本專利技術提供了一種DNA高通量測序建庫方法，包括以下步驟：(1)對待測生物的基因組DNA進行片段化處理，獲得DNA片段化物料；(2)對所述DNA片段化物料進行瓊脂糖凝膠電泳獲得電泳膠塊，切取所述電泳膠塊中文庫目的大小的片段至比所述文庫目的大小的片段大40-60bp的片段范圍內的凝膠，回收凝膠內的DNA獲得第一純化DNA；(3)對所述第一純化DNA進行末端修復和在3`末端加A，末端加A后連接接頭序列獲得連接產物。本專利技術所提供的DNA高通量測序建庫方法能夠在含有多糖、酚類物質、萜類、酯類等雜質污染的復雜環境下對生物DNA進行高通量測序文庫構建，能夠將樣品中與DNA特性接近的雜質去除，提高高通量測序文庫的質量。適用于那些按照本領域現有構建文庫方法，獲得的文庫產出低，同時通過調節DNA純度、反應體積、酶用量等手段仍然無法排除缺陷的，屬于疑難樣品的DNA。可選的，所述待測生物為海洋生物，特別優選的，所述海洋生物為海帶或貝類。本專利技術對于海帶和貝類的具體種類沒有特別的限制，包括所有已知和未知海帶和貝類種類。可選的，所述待測生物為石榴。石榴籽中含有多糖、蛋白質、酯類等雜質物質的干擾，多糖與DNA或者RNA的理化性質相似，抽提過程中易與DNA形成膠狀沉淀，導致最終提取的DNA純度不高。而這些雜質會對建庫過程中酶造成影響。本專利技術所提供的方法能夠去除石榴籽中的雜質物質的干擾，獲得高質量的測序文庫。其中，在步驟(1)中，進行片段化處理的方式包括但不限于超聲波破碎、酶切破碎和微波破碎。其中，在所述DNA片段化物料中，DNA片段的大小為180-600bp。優選的，在步驟(2)中，所述瓊脂糖凝膠電泳的凝膠的濃度為2.0％。可選的，凝膠長度為6cm-12cm。電泳條件為110V，60min或120min(可以根據凝膠長度選擇適當的電泳條件和時間)。其中，在步驟(2)中，若文庫目的大小的片段為300bp，那么應該切取300bp至340bp或360bp范圍內的凝膠。優選切取所述電泳膠塊中文庫目的大小的片段至比所述文庫目的大小的片段大50bp的片段范圍內的凝膠，即如果目的大小的片段為300bp，那么應該切取，300bp至350bp范圍內的凝膠。在本專利技術的一種實施方式中，所使用的DNA膠回收試劑盒為QIAGEN公司QIAquickGelExtractionKit，最終回溶體積為30-60μl，本方法建議回溶體積為55.5-60μl，以便后續實驗不需要補H2O。其中，在步驟(3)中對于進行末端修復、3`端加A、加接頭等建庫步驟的試劑來源、形式沒有特別的要求，但試劑必須能夠完成所述功能。由于片段后物料經過切膠后，符合目的要求的DNA占總量的1/10左右，為保持最適的接頭與DNA的比例，因此本專利技術中所使用的接頭的用量顯著低于本領域加接頭時所使用的接頭用量，可以約為本領域常規接頭用量的1/5-1/10，在本專利技術的一種實施方式中可以按照常規推薦用量的十分之一添加接頭，例如，當所使用的接頭為南京諾唯贊公司(Vazyme)提供的VAHTSDNAAdaptersset1/set2for試劑盒(N801/N802)中提供的接頭時，接頭使用量可以調整為建議用量的1/10，即建議用量為2.5μl，在本專利技術中可以將其稀釋10倍后，使用2.5μl。優選的，在獲得所述連接產物后，還包括利用純化磁珠對所述連接產物進行第二次純化獲得第二次純化后的連接產物，所述純化珠子的用量為所述連接產物體積的1.0-2.0倍，優選為1.8倍。所述方法還包括對所述第二次純化后的連接產物進行SolexaPCR獲得PCR產物，再對所述PCR產物進行第二次凝膠電泳并切膠回收獲得文庫DNA。其中，第二次凝膠電泳和切膠回收的目的是去除非目的DNA、進一步提高文庫片段的均一性，所使用的凝膠濃度優選為2.0％，切膠范圍為電泳亮帶。本專利技術還提供了所述DNA高通量測序建庫方法的應用，所述應用包括對存在于含有多糖、酚類物質、萜類和酯類雜質中的至少一種的環境下的生物進行DNA高通量測序建庫。本專利技術所提供的建庫方法適用于復雜環境中生物DNA的高通量測序建庫，具有以下優點及有益效果：(1)能夠有效低降低樣品雜質對建庫酶活反應的抑制效應，解決高通量測序中部分樣品建庫困難的問題，提高建庫成功率。(2)該方法提供的DNA片段化后切膠回收，其方法簡單，幾乎所有實驗室均有條件實現。(3)該方法對DNA破碎方法、建庫試劑、建庫流程等簡便易行，可以在多種建庫條件下使用，適用性廣泛。附圖說明圖1為海帶DNA樣品利用常規高通量建庫方法文庫結果電泳圖。圖2為海帶DNA樣品利用本專利技術高通量建庫方法文庫結果電泳圖。圖3為貝類DNA樣品利用常規高通量建庫方法文庫結果電泳圖。圖4為貝類DNA樣品利用本專利技術高通量建庫方法文庫結果電泳圖。具體實施方式以下實施例進一步說明本專利技術的內容，但不應理解為對本專利技術的限制本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種DNA高通量測序建庫方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)對待測生物的基因組DNA進行片段化處理，獲得DNA片段化物料；(2)對所述DNA片段化物料進行瓊脂糖凝膠電泳獲得電泳膠塊，切取所述電泳膠塊中文庫目的大小的片段至比所述文庫目的大小的片段大40?60bp的片段范圍內的凝膠，回收凝膠內的DNA獲得第一純化DNA；(3)對所述第一純化DNA進行末端修復，3`末端加A，連接接頭序列獲得連接產物，并對連接產物進行Solexa?PCR擴增，獲得文庫。

【技術特征摘要】
1.一種DNA高通量測序建庫方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)對待測生物的基因組DNA進行片段化處理，獲得DNA片
段化物料；
(2)對所述DNA片段化物料進行瓊脂糖凝膠電泳獲得電泳膠
塊，切取所述電泳膠塊中文庫目的大小的片段至比所述文庫目的大
小的片段大40-60bp的片段范圍內的凝膠，回收凝膠內的DNA獲得
第一純化DNA；
(3)對所述第一純化DNA進行末端修復，3`末端加A，連接接
頭序列獲得連接產物，并對連接產物進行SolexaPCR擴增，獲得文
庫。
2.根據權利要求1所述的DNA高通量測序建庫方法，其特征在
于，在步驟(2)中，所述瓊脂糖凝膠電泳的凝膠的濃度為2.0...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭洪坤，劉慧，宋軍，曹振龍，
申請(專利權)人：北京百邁客生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11