【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及宏基因組及三代測序，具體提供一種三代宏基因組測序文庫的構建方法。
技術介紹
1、微生物組學，作為新興的多學科交叉領域，正在以前所未有的速度改變我們對生命體系的理解。宏基因組測序，作為微生物組研究的核心工具，通過直接分析環境或生物體中的總dna，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及與環境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法。然而，宏基因組測序的挑戰在于處理復雜的樣品，尤其是那些包含低豐度微生物或高gc含量dna的樣本，這些都會導致傳統測序方法的效率和準確性受到限制。
2、隨著三代測序技術的崛起，如pacbio的單分子實時測序技術、ont的納米孔單分子技術，不僅拓寬了測序的視野，還通過提供更長的讀長和更高的測序準確性，彌補了二代測序技術在基因組組裝和物種鑒定上的不足。三代測序技術對于那些需要精確基因組組裝和深度物種鑒定的復雜生態環境研究來說，具有顯著優勢。例如，在研究bvab1這種與細菌性陰道病相關的未培養微生物時，長讀長的三代測序能揭示其基因組的細微結構，從而深入理解該微生物在疾病發生中的作用，為疾病的防治提供新的線索。
3、傳統的文庫構建方法在處理宏基因組時，往往因dna核酸總量不足、質量不好等因素，導致文庫構建困難和測序數據不好。這些可能影響物種豐度的準確評估，以及功能基因的完整捕獲，從而限制了宏基因組學研究的深度和廣度。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于：開發一種優化的三代宏基因組測序文庫構建方法，對于提升
2、本
技術實現思路
旨在提供宏基因組文庫構建方法，結合三代的長讀長測序，能夠在復雜樣品中高效、準確捕捉微生物多樣性，為微生物群落研究、疾病診斷和環境監測提供更深入的分子信息。在構建三代常規文庫前，增在全基因組擴增（mda）技術，以解決宏基因組三代建庫的核酸總量問題。
3、第一方面，本專利技術提供一種三代宏基因組測序文庫的構建方法，包括：宏基因組樣本的dna經mda擴增、磁珠純化、t7內切酶處理和第二次磁珠純化后，獲得純化產物；使用所述純化產物構建三代宏基因測序文庫。
4、mda擴增技術是一種對全基因組序列進行非選擇性擴增的技術，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加dna的總量。這種技術采用多重置換擴增（mda）技術，能對基因組dna進行穩定的擴增。通過使用隨機六堿基引物在多個位點與模板dna退火，然后利用高擴增效率和保真性的phi29?dna聚合酶在dna的多個位點同時起始復制，沿著dna模板合成dna，同時取代模板的互補鏈。這種擴增方式最終可以獲得大量高分子量的dna，保證了擴增產物的長度以及覆蓋率。
5、其次，mda擴增技術使用的phi29?dna聚合酶具有強大的模板結合能力，能夠連續擴增100kb的dna模板而不從模板上解離。同時，這種酶具有3'外切酶活性，可以保證擴增的高保真性。這使得mda擴增技術在擴增產物的高保真性和產量上都具有顯著優勢。
6、綜上所述，mda擴增技術相比常規擴增技術在擴增產物的長度和覆蓋率保證、高保真性和廣泛應用等方面具有明顯優勢，在基因組學研究中展現出顯著的優勢，尤其是在需要高質量dna文庫構建的應用場景中。
7、mda技術雖然具有其獨特的鏈置換擴增機制和高效產物質量，但是mda擴增是采用隨機六聚體引物進行，在擴增過程中會形成分支結構，具有分支結構的文庫在pb測序過程中，會導致測序酶無法持續合成，進而導致測序酶過程終止，進而影響整體測序結果；具有分支結構的文庫在ont測序過程中，會影響馬達蛋白解螺旋活性，進而影響整體測序結果。
8、t7內切酶能夠識別并切割不完全配對的?dna、十字形結構?dna、holliday?結構或交叉?dna、異源雙鏈?dna，也能以較慢速度切割帶切刻的雙鏈?dna。本專利技術通過使用t7內切酶對mda產物進行處理，有效降低了mda擴增過程中的分支結構，使得mda技術能夠用于高質量dna文庫構建中。
9、本專利技術所提供的構建方法適用于pb測序平臺或ont測序平臺。
10、更具體地，本專利技術提供的構建方法適用于pb測序平臺revio測序儀測序，以及ont測序平臺promethion?48測序儀測序。
11、在本專利技術所提供的構建方法中，mda擴增所用試劑盒為諾維贊的discover-scsingle?cell?wga?kit，貨號：n603-01。
12、在本專利技術所提供的構建方法中，磁珠純化所用試劑盒為beckman的agencourtampure?xp?5ml?kit，貨號：a63880。
13、在本專利技術所提供的構建方法中，t7內切酶處理所用試劑盒為諾維贊的t7endonuclease?i，貨號：en303-01。
14、在本專利技術所提供的構建方法中，所用測序平臺為pb測序平臺時，所述構建方法包括：
15、s1：對宏基因組樣本的dna進行mda擴增，獲得mda擴增產物；
16、s2：針對所述mda擴增產物進行t7酶處理；
17、s3：dna損傷修復、末端加a；
18、s4：接頭連接，酶處理，得到待測序三代文庫。
19、在本專利技術所提供的構建方法中，所用測序平臺為pb測序平臺時，所述構建方法包括：
20、s1：對宏基因組樣本的dna進行mda擴增，獲得mda擴增產物；
21、s2：針對所述mda擴增產物進行t7酶處理；
22、s3：dna損傷修復；
23、s4：接頭連接，得到待測序三代文庫。
24、第二方面，本專利技術提供了上述的構建方法在減少宏基因組拼接和注釋的工作量中的應用，針對所述構建方法得到的測序文庫進行測序，得到測序數據，進行生信分析。
25、第三方面，本專利技術提供了上述的構建方法在提高宏基因組數據的質量和完整度中的應用，針對所述構建方法得到的測序文庫進行測序，得到測序數據，進行生信分析。
26、本專利技術充分利用三代測序（pacbio、ont）長度長的優勢，減少了后續的基因組拼接和注釋的工作量，大幅度提高了數據的質量和完整度。
27、本專利技術的有益效果在于：
28、（1）本專利技術提供了一種pb宏基因組文庫構建方法，通過mda以及dna樣品前處理對dna樣品進行增量和純化，解決了因宏基因組提取困難、核酸質量差不滿足pb測序的問題，提高了宏基因組的組裝完整度；
29、（2）本專利技術提供了一種ont宏基因組文庫構建方法，通過mda以及dna樣品前處理對dna樣品進行增量和純化，解決了因宏基因組提取困難、核酸質量差不滿足ont測序的問題，提高了宏基因組的組裝完整度；
30、（3）本專利技術對于提升宏基因組的測序效率和精度，提高物種覆蓋度和基因組均一性，具有重要的科學意義和實際應用價值。...
【技術保護點】
1.一種三代宏基因組測序文庫的構建方法，其特征在于，包括：宏基因組樣本的DNA經MDA擴增、磁珠純化、T7內切酶處理和第二次磁珠純化后，獲得純化產物；使用所述純化產物構建三代宏基因測序文庫。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述構建方法適用于PB測序平臺或ONT測序平臺。
3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，MDA擴增所用試劑盒為諾維贊的Discover-sc?Single?Cell?WGA?Kit。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，磁珠純化所用試劑盒為Beckman的Agencourt?AMPure?XP?5mL?Kit。
5.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，T7內切酶處理所用試劑盒為諾維贊的T7?Endonuclease?I。
6.根據權利要求1-5任一項所述的構建方法，其特征在于，所用測序平臺為PB測序平臺時，所述構建方法包括：
7.根據權利要求1-5任一項所述的構建方法，其特征在于，所用測序平臺為PB測序平臺時，所述構建方法包括：
8.權利要
9.權利要求1-7任一項所述的構建方法在提高宏基因組數據的質量和完整度中的應用，其特征在于，針對所述構建方法得到的測序文庫進行測序，得到測序數據，進行生信分析。
...【技術特征摘要】
1.一種三代宏基因組測序文庫的構建方法，其特征在于，包括：宏基因組樣本的dna經mda擴增、磁珠純化、t7內切酶處理和第二次磁珠純化后，獲得純化產物；使用所述純化產物構建三代宏基因測序文庫。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述構建方法適用于pb測序平臺或ont測序平臺。
3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，mda擴增所用試劑盒為諾維贊的discover-sc?single?cell?wga?kit。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，磁珠純化所用試劑盒為beckman的agencourt?ampure?xp?5ml?kit。
5.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張雪川，鄭洪坤，趙慶，畢經德，
申請(專利權)人：北京百邁客生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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