一種單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)針對(duì)若干目的基因分別設(shè)計(jì)若干對(duì)基本擴(kuò)增引物；(2)設(shè)計(jì)一對(duì)不對(duì)稱連接探針和一不與人類基因組形成互補(bǔ)的通用引物；(3)將模板、上述若干對(duì)基本擴(kuò)增引物、不對(duì)稱探針、通用引物置于一含有DNA連接酶和DNA末端修飾酶的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增的程序依次包括：預(yù)變性、第一階段擴(kuò)增和第二階段擴(kuò)增；(4)將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，即得所述高通量測(cè)序文庫(kù)。本發(fā)明專利技術(shù)的單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法針對(duì)多個(gè)靶序列進(jìn)行單管，快速完成文庫(kù)的構(gòu)建，結(jié)合高通量測(cè)序平臺(tái)可以十分有效的解決目前對(duì)于臨床上腫瘤、遺傳病等疾病中在少量的臨床樣本基礎(chǔ)上需要對(duì)體細(xì)胞多基因、多靶點(diǎn)檢測(cè)這一難點(diǎn)，且成本低廉。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法
本專利技術(shù)屬于檢測(cè)生物
，具體涉及一種單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
分子生物學(xué)診斷技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)取得巨大進(jìn)步的結(jié)晶，是在人們對(duì)基因的結(jié)構(gòu)以及基因的表達(dá)和調(diào)控等生命本質(zhì)問(wèn)題的認(rèn)識(shí)日益加深的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。近年來(lái)，分子生物學(xué)診斷技術(shù)的方法學(xué)研究取得了很大進(jìn)展，先后建立了限制性內(nèi)切酶酶譜分析、核酸分子雜交、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性連鎖分析等方法。1985年由美國(guó)Cetus公司人類遺傳學(xué)研究室Mullis等創(chuàng)立并隨后迅速發(fā)展起來(lái)的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)(PolymeraseChainReaction,PCR)，以及90年代發(fā)展起來(lái)的DNA芯片技術(shù)(DNAChip)，又將分子生物學(xué)診斷技術(shù)提高到一個(gè)嶄新的階段。大部分分子診斷實(shí)驗(yàn)室的核心技術(shù)都主要集中在檢測(cè)特異性、相對(duì)較短的DNA或RNA片段上。隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，越來(lái)越多疾病的發(fā)生機(jī)制與相關(guān)基因的變異有關(guān)，如遺傳性疾病β-地中海貧血與基因缺失相關(guān)，遺傳性耳聾與GJB2、SLC26A4和線粒體DNAA1555G和C1494T突變相關(guān)，苯丙酮尿癥在中國(guó)人群中已發(fā)現(xiàn)了70種以上基因突變，家族遺傳性乳腺癌與BRCA1/2基因突變相關(guān)等等。因此與疾病相關(guān)的基因突變呈現(xiàn)多基因、多種變異類型(點(diǎn)突變，插入，缺失)。臨床迫切需要一種能夠同時(shí)檢測(cè)多基因、多變異位點(diǎn)的方法。世界各國(guó)高度重視分子診斷技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序成為新一代分子診斷試劑開(kāi)發(fā)的主流。高通量測(cè)序是分子生物學(xué)、微電子、計(jì)算機(jī)等多學(xué)科結(jié)合的結(jié)晶，綜合了多種現(xiàn)代高精尖技術(shù)。高通量測(cè)序具有同時(shí)能夠檢測(cè)多個(gè)靶點(diǎn)的功能，具有快速有效的特點(diǎn)。因而高通量測(cè)序成為新一代分子診斷試劑的主要開(kāi)發(fā)方向?，F(xiàn)有高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法主要分為兩種：一種是Ampliseq技術(shù)，即利用多重PCR技術(shù)多靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化，通過(guò)DNA連接酶將特定序列連接至擴(kuò)增產(chǎn)物兩端，再次純化并進(jìn)行擴(kuò)增。該缺點(diǎn)是操作步驟多，文庫(kù)構(gòu)建時(shí)間久，約需要8個(gè)小時(shí)。另一種是通過(guò)探針捕獲技術(shù)，即將樣本DNA進(jìn)行打斷，篩選出目標(biāo)長(zhǎng)度大小，利用帶有標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，使用帶標(biāo)記的磁珠與標(biāo)記的探針結(jié)合，洗脫捕獲所有目標(biāo)序列，后進(jìn)行特異序列的連接并擴(kuò)增。該方法缺點(diǎn)是雜交效率低，文庫(kù)構(gòu)建時(shí)間久約需要24小時(shí)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法。本專利技術(shù)的具體技術(shù)方案如下：一種單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)針對(duì)若干目的基因分別設(shè)計(jì)若干對(duì)基本擴(kuò)增引物，在基本擴(kuò)增引物的正向引物和反向引物的5’端均連接2～5個(gè)T，并在該2～5個(gè)T的靠近3’端的第一個(gè)T上進(jìn)行PNA修飾，與目的基因無(wú)關(guān)，既不影響起始PCR擴(kuò)增反應(yīng)的效率，也不會(huì)造成引物對(duì)之間的非特異性擴(kuò)增，使得擴(kuò)增產(chǎn)物能夠產(chǎn)生粘性末端，該若干對(duì)基本擴(kuò)增引物的Tm值相差不超過(guò)1℃，相應(yīng)的退火溫度為56～64℃；(2)設(shè)計(jì)一對(duì)不對(duì)稱連接探針和一不與人類基因組形成互補(bǔ)的通用引物，該對(duì)不對(duì)稱連接探針包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對(duì)稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對(duì)的互補(bǔ)序列、一與所述通用引物互補(bǔ)配對(duì)的擴(kuò)增序列和一與上述2～5個(gè)T相對(duì)應(yīng)的粘性末端識(shí)別序列，上述正向探針和反向探針的Tm值相差不超過(guò)1℃，且上述正向探針和反向探針自身形成環(huán)狀的退火溫度與基本擴(kuò)增引物的退火溫度相差不超過(guò)1℃；(3)將模板、上述若干對(duì)基本擴(kuò)增引物、不對(duì)稱探針、通用引物置于一含有DNA連接酶和DNA末端修飾酶的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增的程序的時(shí)間為2～3h，并依次包括：預(yù)變性、第一階段擴(kuò)增和第二階段擴(kuò)增，其中第一階段擴(kuò)增依次包括第一變性階段、第一退火階段和第一延伸循環(huán)階段，第一延伸循環(huán)階段的循環(huán)數(shù)為5～15，第一退火階段的退火溫度為60～65℃，第二階段擴(kuò)增依次包括第二變性階段、第二退火階段和第二延伸循環(huán)階段，第二延伸循環(huán)階段的循環(huán)數(shù)為15～30(優(yōu)選為20)；第一退火階段的退火溫度比第二退火階段的退火溫度高4～8℃；由于每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)第一階段擴(kuò)增之后，本專利技術(shù)設(shè)計(jì)的基本擴(kuò)增引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物得到大量的積累，這些積累的產(chǎn)物又重新作為第二階段擴(kuò)增的模板，此時(shí)通用引物能夠與這些模板完全匹配，結(jié)合效率大幅度提升；(4)將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，即得所述高通量測(cè)序文庫(kù)。在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述互補(bǔ)序列和擴(kuò)增序列之間還設(shè)有一標(biāo)記序列，用以對(duì)不同樣本進(jìn)行識(shí)別。在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述標(biāo)記序列的長(zhǎng)度為10～15bp。在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度為3～5bp。在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述通用引物的長(zhǎng)度為10～15bp。在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述不對(duì)稱連接探針的正向探針和反向探針的長(zhǎng)度均不大于50bp。在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DNA連接酶為T(mén)4DNA連接酶。本專利技術(shù)的有益效果是：(1)本專利技術(shù)的單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法針對(duì)多個(gè)靶序列進(jìn)行單管，快速完成文庫(kù)的構(gòu)建，整個(gè)文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程僅需要2～3小時(shí)，手動(dòng)時(shí)間僅僅需要15～30分鐘即可，結(jié)合高通量測(cè)序平臺(tái)可以十分有效的解決目前對(duì)于臨床上腫瘤、遺傳病等疾病中在少量的臨床樣本基礎(chǔ)上需要對(duì)體細(xì)胞多基因、多靶點(diǎn)檢測(cè)這一難點(diǎn)，且成本低廉；(2)本專利技術(shù)的構(gòu)建方法所制備的文庫(kù)序列可被目前高通量測(cè)序系統(tǒng)識(shí)別并進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)文庫(kù)構(gòu)建進(jìn)行核酸序列的檢測(cè)的應(yīng)用，該核酸檢測(cè)可應(yīng)用于目前多種高通量測(cè)序平臺(tái)、基因芯片平臺(tái)、雜交檢測(cè)平臺(tái)。附圖說(shuō)明圖1為本專利技術(shù)的第一階段擴(kuò)增和第二階段擴(kuò)增的示意圖；圖2為本專利技術(shù)實(shí)施例1的高通量測(cè)序芯片總的Reads數(shù)量圖3為本專利技術(shù)實(shí)施例1的3個(gè)樣本分別Reads數(shù)量和平均長(zhǎng)度圖4為本專利技術(shù)實(shí)施例1的樣本數(shù)據(jù)與目標(biāo)序列的匹配度圖5為本專利技術(shù)實(shí)施例1的每個(gè)樣本的匹配度和均一性具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本專利技術(shù)的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明和描述。如圖1所示，本專利技術(shù)的技術(shù)方案為：一種單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)針對(duì)若干目的基因分別設(shè)計(jì)若干對(duì)基本擴(kuò)增引物，在基本擴(kuò)增引物的正向引物F1和反向引物R1的5’端均連接2～5個(gè)T10，并在該2～5個(gè)T10的靠近3’端的第一個(gè)T上進(jìn)行PNA修飾，該若干對(duì)基本擴(kuò)增引物的Tm值相差不超過(guò)1℃，相應(yīng)的退火溫度為56～64℃；(2)設(shè)計(jì)一對(duì)不對(duì)稱連接探針和一不與人類基因組形成互補(bǔ)的通用引物F3，該對(duì)不對(duì)稱連接探針包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針F2和一反向探針R2，該正向探針F2和反向探針R2從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對(duì)稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對(duì)的互補(bǔ)序列11、一標(biāo)記序列(barcode)12、一與所述通用引物F3互補(bǔ)配對(duì)的擴(kuò)增序列13和一與上述2～5個(gè)T相對(duì)應(yīng)的粘性末端識(shí)別序列14，上述正向探針F2和反向探針R2的Tm值相差不超過(guò)1℃，且上述正向探針F2和反向探針自身形成環(huán)狀的退火溫度與基本擴(kuò)增引物的退火溫度相差不超過(guò)1℃；(3)將模板、上述若干對(duì)基本擴(kuò)增引物F1和R1、不對(duì)稱探針F2和R2、通用引物F3置于一含有DNA連接酶和DNA末端修飾酶的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于：包括如下步驟：(1)針對(duì)若干目的基因分別設(shè)計(jì)若干對(duì)基本擴(kuò)增引物，在基本擴(kuò)增引物的正向引物和反向引物的5’端均連接2～5個(gè)T，并在該2～5個(gè)T的靠近3’端的第一個(gè)T上進(jìn)行PNA修飾，該若干對(duì)基本擴(kuò)增引物的Tm值相差不超過(guò)1℃，相應(yīng)的退火溫度為56～64℃；(2)設(shè)計(jì)一對(duì)不對(duì)稱連接探針和一不與人類基因組形成互補(bǔ)的通用引物，該對(duì)不對(duì)稱連接探針包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對(duì)稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對(duì)的互補(bǔ)序列、一與所述通用引物互補(bǔ)配對(duì)的擴(kuò)增序列和一與上述2～5個(gè)T相對(duì)應(yīng)的粘性末端識(shí)別序列，上述正向探針和反向探針的Tm值相差不超過(guò)1℃，且上述正向探針和反向探針自身形成環(huán)狀的退火溫度與基本擴(kuò)增引物的退火溫度相差不超過(guò)1℃；(3)將模板、上述若干對(duì)基本擴(kuò)增引物、不對(duì)稱探針、通用引物置于一含有DNA連接酶和DNA末端修飾酶的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增的程序的時(shí)間為2～3h，并依次包括：預(yù)變性、第一階段擴(kuò)增和第二階段擴(kuò)增，其中第一階段擴(kuò)增依次包括第一變性階段、第一退火階段和第一延伸循環(huán)階段，第一延伸循環(huán)階段的循環(huán)數(shù)為5～15，第一退火階段的退火溫度為60～65℃，第二階段擴(kuò)增依次包括第二變性階段、第二退火階段和第二延伸循環(huán)階段，第二延伸循環(huán)階段的循環(huán)數(shù)為15～30；第一退火階段的退火溫度比第二退火階段的退火溫度高4～8℃；(4)將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，即得所述高通量測(cè)序文庫(kù)。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種單管高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于：包括如下步驟：(1)針對(duì)若干目的基因分別設(shè)計(jì)若干對(duì)基本擴(kuò)增引物，在基本擴(kuò)增引物的正向引物和反向引物的5’端均連接2～5個(gè)T，并在該2～5個(gè)T的靠近3’端的第一個(gè)T上進(jìn)行PNA修飾，該若干對(duì)基本擴(kuò)增引物的Tm值相差不超過(guò)1℃，相應(yīng)的退火溫度為56～64℃；(2)設(shè)計(jì)一對(duì)不對(duì)稱連接探針和一條不與人類基因組形成互補(bǔ)的通用引物，該對(duì)不對(duì)稱連接探針包括可自身形成環(huán)狀的一條正向探針和一條反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一段能夠與不對(duì)稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對(duì)的互補(bǔ)序列、一段與所述通用引物互補(bǔ)配對(duì)的擴(kuò)增序列和一段與上述2～5個(gè)T相對(duì)應(yīng)的粘性末端識(shí)別序列，上述正向探針和反向探針的Tm值相差不超過(guò)1℃，且上述正向探針和反向探針自身形成環(huán)狀的退火溫度與基本擴(kuò)增引物的退火溫度相差不超過(guò)1℃；(3)將模板、上述若干對(duì)基本擴(kuò)增引物、不對(duì)稱探針、通用引物置于一含有DNA連接酶和DNA末端修飾酶的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增的程序的時(shí)間為2～3h，并依次包括：預(yù)變性、第一階段擴(kuò)增和第二階段擴(kuò)增，其中第一階段擴(kuò)增依次包括第一...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳琰，郭飛飛，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廈門(mén)飛朔生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：福建;35