【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，尤其涉及一種基于高通量測序檢測子宮平滑肌瘤fh和med12基因突變的文庫構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
1、子宮平滑肌瘤是女性生殖系統(tǒng)中最常見的良性腫瘤，主要的基因變異包括med12突變，hmga2、hmga1重排，col4a5、col4a6缺失，fh突變。其中，fh基因編碼延胡索酸水合酶(fumarate?hydratase)，位于染色體1q42.3-q43，大小約22kb，含有10個外顯子，基因產(chǎn)物為fh，是三羧酸循環(huán)中催化延胡索酸+h2o--蘋果酸反應的關(guān)鍵酶。fh基因胚系突變引起遺傳性平滑肌瘤病和腎細胞癌綜合征(hlrcc)，是一種常染色體顯性綜合征，以子宮、皮膚平滑肌瘤和腎細胞癌(rcc)為特征。fh基因突變引起雙等位基因失活導致fh活性完全喪失或降低，造成細胞內(nèi)延胡索酸積累，糖酵解加強，引起不依賴低氧環(huán)境的低氧誘導因子1α(hif-1α)穩(wěn)定表達，細胞內(nèi)微環(huán)境改變，從而有利于腫瘤發(fā)生。
2、fh缺陷型平滑肌瘤基因突變類型包括體系突變和胚系突變兩種，研究表明fh基因的體系突變較胚系突變更常見，fh基因的體系突變與hlrcc無關(guān)。fh免疫組化不能代替基因檢測，僅利用fh的免疫組化對hlrcc患者進行篩選會造成漏診。基因檢測才是診斷fh缺陷型子宮平滑肌瘤的金標準。
3、根據(jù)文獻報道，子宮平滑肌瘤形成的分子機制中，絕大多數(shù)fh缺陷型患者是由于fh基因雜合性缺失(loh)導致雙等位基因fh失活，體細胞med12突變和基因拷貝數(shù)缺失。而對于散發(fā)性子宮平滑肌瘤最常見的是med12基因突變引起。納入
4、目前，針對于fh基因檢測臨床主要采用一代測序，由于fh基因無明確的熱點突變，一代測序檢測需要覆蓋fh基因10個外顯子，需要10對擴增引物進行10個pcr反應和10個測序反應，實驗操作繁瑣，成本高，而且未納入med12基因的檢測。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、鑒于fh重要的臨床意義和子宮平滑肌瘤的分子機制，本專利技術(shù)提供一種基于高通量測序檢測子宮平滑肌瘤fh和med12基因突變的文庫構(gòu)建方法，可實現(xiàn)單管pcr建庫完成fh和med12基因突變檢測，同時，引入內(nèi)參序列擴增(ref_gene-1～ref_gene-14)，實現(xiàn)fh基因拷貝數(shù)的檢測，具有操作簡單、樣本投入量少等優(yōu)勢。本專利技術(shù)提供的建庫方法可用于定性檢測子宮肌瘤組織樣本/外周血樣本中的fh基因和med12突變，輔助遺傳性平滑肌瘤病及腎細胞癌(hlrcc)綜合征篩查。
2、本專利技術(shù)的文庫構(gòu)建方法的原理是基于多重pcr的擴增子靶向測序，先使用針對目標區(qū)域的特異修飾性擴增引物(gsp)對dna模板的靶序列進行精準pcr擴增富集，再使用一對帶有測序接頭序列的接頭擴增引物，用于對富集產(chǎn)物進行擴增并加上測序接頭，通過兩步pcr完成測序文庫的構(gòu)建。
3、本專利技術(shù)結(jié)合優(yōu)化的pcr反應程序和高特異ringcap-taq酶的使用，在普通pcr平臺上實現(xiàn)對樣品核酸中目標序列進行用于高通量測序使用的文庫構(gòu)建，以實現(xiàn)對多基因多靶點突變進行準確、快速檢測。
4、本專利技術(shù)設計及應用所用的引物序列如下表1所示：
5、表1
6、
7、
8、
9、其中，ill-ixx-p5和ill-ixx-p7序列中的“nnnnnnn”為index，可根據(jù)所用index序列進行替換，并將引物名稱修改為相應編號，如ll-i01-p5和ill-i01-p7。
10、為了實現(xiàn)單管pcr建庫檢測fh和med12基因突變，現(xiàn)提供一種基于高通量測序檢測子宮平滑肌瘤fh和med12基因突變的文庫構(gòu)建方法：
11、1.使用優(yōu)化好的pcr富集反應液(參照表2和表3)，以dna樣本為模板根據(jù)表4程序擴增目標基因序列，得到pcr產(chǎn)物。
12、表2.pcr富集反應液基礎(chǔ)配方
13、
14、
15、表3.引物mix配方
16、
17、
18、表4.富集反應擴增程序
19、
20、2.磁珠純化pcr產(chǎn)物，得到富集產(chǎn)物。
21、3.使用帶有測序接頭序列和標簽序列(index)接頭擴增引物配制序接頭連接反應液(配方見表5)對富集產(chǎn)物，按照表6程序進行二輪擴增。
22、表5.測序接頭連接反應液配方
23、
24、表6.接頭連接反應擴增程序
25、
26、4.擴增產(chǎn)物采用磁珠純化后，得到樣本的文庫。
27、5.將文庫用于下一步高通量測序儀器進行檢測，得到目標序列信息，即fastq文件。
28、6.fastq文件經(jīng)生物信息學分析處理，進行數(shù)據(jù)質(zhì)控、序列比對、突變注釋和拷貝數(shù)分析。其中，拷貝數(shù)分析的原理為計算fh基因各個外顯子的覆蓋深度占比和對應外顯子基線占比的比值cnv-ratio，若cnv-ratio≤0.8，則判定為該外顯子發(fā)生拷貝數(shù)缺失；若cnv-ratio≥1.2，則判定為該外顯子未發(fā)生拷貝數(shù)缺失；若0.8<cnv-ratio<1.2，則提示該外顯子可能存在拷貝數(shù)缺失。
29、上述基于高通量測序檢測子宮平滑肌瘤fh和med12基因突變的文庫構(gòu)建方法，包括引物設計和實驗流程的優(yōu)化。文庫僅以illumina平臺接頭為例，也根據(jù)引物設計思路，更換不同的測序接頭序列，以實現(xiàn)兼容不同測序平臺，包括華大智造，ion?torrent等。
30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下有益效果：
31、1)整合了fh突變和med12突變的檢測，由于兩個基因在子宮平滑肌瘤的形成機制上是互斥的，med12突變的檢測結(jié)果能進一步的輔助遺傳性平滑肌瘤病及腎細胞癌(hlrcc)綜合征篩查；2)通過引物設計實現(xiàn)了單管pcr建庫完成fh和med12基因突變檢測，相較于需要10管pcr擴增和10次測序反應的一代測序檢測，具有操作簡單、樣本投入量少等優(yōu)勢；3)通過引入內(nèi)參序列擴增，和基線樣本分析，實現(xiàn)fh基因拷貝數(shù)的檢測；4)所有引物對擴增長度均控制在200bp以內(nèi)，適用于血液樣本或一定程度降解的石蠟樣本來源的dna建庫。本專利技術(shù)解決了現(xiàn)行一代測序檢測fh突變的不足，更適合于臨床檢測。
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1.一種基于高通量測序構(gòu)建子宮平滑肌瘤FH和MED12基因突變文庫的多重PCR引物，其特征在于，所述PCR引物序列如SEQ?ID?NO.1-82所示。
2.一種基于高通量測序檢測子宮平滑肌瘤FH和MED12基因突變的文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述文庫構(gòu)建方法包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中多重PCR反應的體系如下表所示：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述引物MIX的具體組成如下表所示：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述多重PCR反應的程序如下表所示：
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述待測樣品為FFPE樣本、新鮮組織或外周血基因組DNA。
7.權(quán)利要求1-5中任一項所述的文庫構(gòu)建方法構(gòu)建得到的文庫。
8.權(quán)利要求6所述的文庫構(gòu)建方法構(gòu)建得到的文庫。
9.權(quán)利要求1所述的多重PCR引物在構(gòu)建子宮平滑肌瘤FH和MED12基因突變文庫中的應用。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于高通量測序構(gòu)建子宮平滑肌瘤fh和med12基因突變文庫的多重pcr引物，其特征在于，所述pcr引物序列如seq?id?no.1-82所示。
2.一種基于高通量測序檢測子宮平滑肌瘤fh和med12基因突變的文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述文庫構(gòu)建方法包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中多重pcr反應的體系如下表所示：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述引物mix的具體組成如...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳志宏，鐘鎮(zhèn)濤，鄭甜，吳志煌，陳琰，
申請(專利權(quán))人：廈門飛朔生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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