【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種重組谷氨酸棒桿菌，及重組谷氨酸棒桿菌在發酵合成微生物靛藍色素的應用，本專利技術還涉及定量分析l-谷氨酰胺的方法，屬于生物。
技術介紹
1、微生物合成的靛藍色素由l-谷氨酰胺(gln)通過4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶活化的非核糖體多肽合成酶(nrps)催化合成，相對人工化學合成的靛藍色素，微生物合成過程有安全性高、污染低、成本低等優點，可以作為環保型天然色素，具有較為廣闊的應用前景。然而天然的靛藍色素生產菌種的色素合成因受到嚴格調控，其產量都很低，通過將靛藍色素合成酶及相關基因轉移到模式發酵菌株中，可以有效提高靛藍色素產量。相比常用的靛藍合成重組宿主大腸桿菌而言，corynebacterium?glutamicum?atcc14067具有如下優點：(1)生物安全性高，并兼有營養需求低、生長速度快等特點；(2)更強的l-谷氨酸合成能力，可大量合成靛藍合成的底物gln；(3)具有能活化靛藍合成酶的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶。
2、另外，gln是動物細胞生長重要的能量和營養物質，但因其穩定性較差，在培養過程中需要臨用時或定時補充，在細胞培養、臨床治療危重病人腸外營養補充、特醫食品等方面應用廣泛。因此在科學研究、生產過程控制、質量分析等方面對于gln的快速且準確的定量檢測具有重要意義和價值。目前市售快速檢測試劑盒主要是基于雙酶法的l-谷氨酰胺測量方法，通常是基于l-谷氨酰胺酶和l-谷氨酸脫氫酶的雙酶組合，涉及多種昂貴的輔因子，并且需要發生兩次連續的脫氨反應。這種方法不僅增加了一個額外的反應步驟，更為重要的是，
3、chrysanthemi)、bpsa(streptomyces?lavendulae)、sc-indc(streptomyces
4、chromofuscus)與外源的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶在大腸桿菌中分別表達后在體內或體外進行活化，并需要將酶純化后用于gln的檢測，過程較為繁瑣。
技術實現思路
1、本專利技術的第一個目的是提供一種合成靛藍色素的重組谷氨酸棒桿菌的構建方法。該方法選用來源于vogesella?indigofera的靛藍合成酶igid，優選的宿主corynebacterium?glutamicum?atcc14067(即c.glutamicum?atcc14067)能在體內有效激活igid，因此無需共表達外源4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶。
2、本專利技術的第二個目的是高值化綜合利用重組谷氨酸棒桿菌發酵靛藍色素后的菌體，將菌體中過量合成的活性靛藍合成酶idid與靛藍色素快速有效分離，以此為基礎建立針對復雜生物樣品中gln含量的快速檢測方法。
3、為達到上述目的，本專利技術的技術方案：
4、一、合成靛藍色素重組谷氨酸棒桿菌構建
5、將合成的vogesella?indigofera的靛藍合成酶igid基因置于谷氨酸棒桿菌穿梭表達載體pekex2的tac啟動子控制下。為便于后續可選的純化操作，igid的n端添加6*his序列，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。構建的重組質粒pekex2-igid經測序驗證后，電擊轉化至優選的表達宿主corynebacterium?glutamicum?atcc14067，篩選獲得正確的重組谷氨酸棒桿菌得到c.glutamicum?igid。
6、二、重組谷氨酸棒桿菌發酵合成靛藍色素及活性靛藍合成酶分離
7、采用搖瓶發酵方法，挑取bhis固體培養基上重組c.glutamicum?igid單菌落，接種至含20g/l葡萄糖的bhis培養基中，30℃，200?-250rpm活化培養12-14h，培養物轉接種子培養基，同樣條件下培養14-20h獲得種子培養液。種子培養液轉接至發酵培養基，30℃，200-250rpm培養至適當時機，添加適量誘導劑iptg，18-25℃，200-250rpm繼續培養至48-72h。以上培養過程均在培養基中加入卡那霉素至終濃度50μg/ml。
8、發酵結束后，4℃，5000rpm離心分離菌體。菌體經20mm?tris-hcl(ph＝8.0,)洗滌兩次后懸浮于含適量溶菌酶的緩沖溶液中，37℃孵育一定時間，冰水浴條件下超聲波破壁或高壓均質破壁。破壁液立即于4℃，15,000*g離心10分鐘，分別收集上清液和破壁細胞沉淀。上清液經0.22μm無菌濾膜過濾后加入終濃度為50％的無菌甘油，混勻后即為靛藍合成酶粗酶液，-20℃保存。粗酶液也可經鎳親和層析柱純化后制備成純酶液。因靛藍色素不溶于水相，與細胞碎片一同保留于沉淀中。沉淀部分經含1％吐溫-80的去離子水洗滌后，加入二甲亞砜(dmso)，60-80℃熱水浴溶解提取靛藍色素。結束后離心或過濾，收集液體相。
9、三、靛藍合成酶用于復雜生物樣品中gln檢測方法
10、重組靛藍合成酶酶液可以是來源于前述的破壁細胞提取的粗酶液，也可以是經過ni親和柱純化后的純酶液或其冷凍干燥的固相酶。優選的重組靛藍合成酶來源于vogesella?indigofera的igid。
11、將獲得的靛藍合成酶酶液與含鎂離子、atp的緩沖液，生物樣品按照合適的比例加入96孔板，混勻，于25-35℃反應5-20分鐘，加入dmso或dmf于反應體系中至體積濃度為60％-90％終止酶反應，并于25-35℃振蕩孵育溶解催化生成的靛藍色素10-20分鐘，以蒸餾水代替樣品作為空白，測定各孔590-610nm吸光度值。標準曲線按照同樣方法進行，通過標準曲線計算樣品中gln濃度。
12、本專利技術的有益效果：
13、本專利技術選用vogesella?indigofera來源的靛藍合成酶igid可以有效地被宿主細菌c.glutamicum?atcc14067內源的活化酶活化，無需另外共表達外源4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶，重組細菌無需消耗額外資源表達外源4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶，靛藍發酵過程更易于調控，重組細菌穩定性更好。
14、本專利技術選用的宿主細菌c.glutamicum?atcc14067為公認安全菌株，能利用葡萄糖等簡單碳源合成谷氨酸，為靛藍色素合成底物l-谷氨酰胺的合成提供了大量前體。重組c.glutamicum?igid在沒有額外添加谷氨酰胺的發酵培養基中經30℃，250rpm培養6h后0.5mm?iptg誘導，25℃發酵72h時，靛藍色素產量達到2.8g/l。
15、本專利技術開發的無需共表達外源活化酶的重組谷氨酸棒桿菌株能利用本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于：通過將來源于Vogesella?Indigofera的靛藍合成酶IgiD重組至穿梭表達載體pEKEX2的tac啟動子下，以Corynebacterium?glutamicumATCC14067為表達宿主，構建重組谷氨酸棒桿菌；所述靛藍合成酶IgiD序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.權利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌在發酵合成微生物靛藍色素的應用。
3.根據權利要求2所述的重組谷氨酸棒桿菌在發酵合成微生物靛藍色素的應用，其特征在于：在發酵合成過程中，發酵培養基中無需添加L-谷氨酰胺。
4.利用權利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌發酵生產靛藍色素廢棄細胞中重組靛藍合成酶粗酶液快速定量分析復雜樣品中L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：利用廢棄細胞破壁獲得的重組靛藍合成酶粗酶液專一性催化L-谷氨酰胺合成高消光系數的靛藍色素這一特性，在25-35℃，以樣品中L-谷氨酰胺為底物，在反應體系中反應10-20分鐘，專一性催化生成不溶于水相的靛藍色素，用DMSO溶解后進行比色分析。
5.根據權利要求4所述的定量分析復雜樣
6.利用權利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌發酵生產靛藍色素廢棄細胞中重組靛藍合成酶純化酶液快速定量分析復雜樣品中L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：利用廢棄細胞破壁獲得的重組靛藍合成酶經組氨酸標簽親和填料吸附，收集重組靛藍合成酶所在主要餾分后與保護液混合制備獲得的純化酶；利用純化的重組靛藍合成酶專一性催化L-谷氨酰胺合成高消光系數的靛藍色素這一特性，在25-35℃，以樣品中L-谷氨酰胺為底物，在所述的反應體系中反應10-20分鐘，專一性催化生成不溶于水相的靛藍色素，用DMSO溶解后進行比色分析。
7.根據權利要求6所述的定量分析復雜樣品中L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：在590-610nm波長下進行比色分析。
...【技術特征摘要】
1.重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于：通過將來源于vogesella?indigofera的靛藍合成酶igid重組至穿梭表達載體pekex2的tac啟動子下，以corynebacterium?glutamicumatcc14067為表達宿主，構建重組谷氨酸棒桿菌；所述靛藍合成酶igid序列如seq?id?no.1所示。
2.權利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌在發酵合成微生物靛藍色素的應用。
3.根據權利要求2所述的重組谷氨酸棒桿菌在發酵合成微生物靛藍色素的應用，其特征在于：在發酵合成過程中，發酵培養基中無需添加l-谷氨酰胺。
4.利用權利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌發酵生產靛藍色素廢棄細胞中重組靛藍合成酶粗酶液快速定量分析復雜樣品中l-谷氨酰胺的方法，其特征在于：利用廢棄細胞破壁獲得的重組靛藍合成酶粗酶液專一性催化l-谷氨酰胺合成高消光系數的靛藍色素這一特性，在25-35℃，以樣品中l-谷氨酰胺為底物，在反應體系...
【專利技術屬性】
技術研發人員：朱益波，袁天慧，張怡婷，趙鈺，成琦，彭銳洪，任聰，徐得磊，
申請(專利權)人：常熟理工學院，
類型：發明
國別省市：
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