具有膠原特異結(jié)合能力的神經(jīng)再生抑制分子的拮抗蛋白CBD-EphA4LBD及應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種具有膠原特異結(jié)合能力的神經(jīng)再生抑制分子的拮抗蛋白CBD-EphA4LBD及應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)提供的融合蛋白，命名為融合蛋白CBD-EphA4LBD，包括CBD區(qū)段和EphA4LBD區(qū)段；所述CBD區(qū)段由序列表中序列2自氨基末端第22至28位氨基酸殘基組成；所述EphA4LBD區(qū)段由序列表中序列2自氨基末端第40至213位氨基酸殘基組成。融合蛋白CBD-EphA4LBD具有很好的膠原特異結(jié)合能力，能促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)絲伸長，具有很好修復(fù)效果及良好的臨床應(yīng)用前景。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及具有膠原特異結(jié)合能力的神經(jīng)再生抑制分子的拮抗蛋白CBD-EphA4LBD及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
脊髓是中樞神經(jīng)的重要組成部分，主要功能是傳送腦與外周之間的神經(jīng)信息同時也是許多簡單反射活動的低級中樞。脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)多見于一些自然災(zāi)難之中，如地震和礦難等，另外，在交通事故和一些運動性損傷中也常有發(fā)生。脊髓損傷后通常在受損的節(jié)位以下表現(xiàn)出軀體自主運動功能及感覺的缺失。在脊髓受損后，損傷的以及殘存的正常脊髓神經(jīng)元很難自發(fā)再生進(jìn)入或跨越損傷區(qū)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種具有膠原特異結(jié)合能力的神經(jīng)再生抑制分子的拮抗蛋白CBD-EphA4LBD及應(yīng)用。本專利技術(shù)首先提供了一種融合蛋白，命名為融合蛋白CBD-EphA4LBD，包括CBD區(qū)段和EphA4LBD區(qū)段；所述CBD區(qū)段由序列表中序列2自氨基末端第22至28位氨基酸殘基組成；所述EphA4LBD區(qū)段由序列表中序列2自氨基末端第40至213位氨基酸殘基組成。所述融合蛋白中，所述CBD區(qū)段位于所述EphA4LBD區(qū)段的上游。所述融合蛋白具體可為如下(a)或(b)：(a)序列表中序列2自氨基末端第22至213位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。編碼所述融合蛋白的基因也屬于本專利技術(shù)的保護(hù)范圍。所述基因中，編碼所述CBD區(qū)段的DNA分子可如序列表的序列1自5’末端第64至84位核苷酸所示，編碼所述EphA4LBD區(qū)段的DNA分子可如序列表的序列1自5’末端第118至639位核苷酸所示。所述基因具體可為如下(c)或(d)：(c)序列表的序列1自5’末端第64至639位核苷酸所示的DNA分子；(d)序列表的序列1所示的DNA分子。含有所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本專利技術(shù)的保護(hù)范圍。所述重組載體可為在pET28a(+)載體多克隆位點插入序列表的序列1自5’末端第64-642位核苷酸所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為將pET28a(+)載體NdeI和XhoI酶切識別序列之間的小片段替換為序列表的序列1自5’末端第64-642位核苷酸所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒pET28a-6his-CBD-EphA4LBD。所述重組菌可為將以上任一所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到的重組菌。以上任一所述融合蛋白或以上任一所述基因在制備促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的藥物中的應(yīng)用也屬于本專利技術(shù)的保護(hù)范圍。所述促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)可為促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)絲伸長和/或促進(jìn)脊髓損傷處神經(jīng)纖維增長和/或促進(jìn)脊髓損傷處5-HT型運動神經(jīng)元增長。本專利技術(shù)還保護(hù)一種促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的藥物，其活性成分為如下(e)或(f)：(e)以上任一所述的融合蛋白；(f)結(jié)合有以上任一所述的融合蛋白的膠原支架。所述促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)可為促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)絲伸長和/或促進(jìn)脊髓損傷處神經(jīng)纖維增長和/或促進(jìn)脊髓損傷處5-HT型運動神經(jīng)元增長。結(jié)合有所述融合蛋白的膠原支架具體可采用如下方法制備：將膠原支架用含有所述融合蛋白的溶液室溫孵育。所述室溫孵育的時間具體可為半小時。“含有所述融合蛋白的溶液”具體可為用PBS緩沖液溶解所述融合蛋白得到的溶液。每20微升“含有所述融合蛋白的溶液”中可含有5微克所述融合蛋白。所述膠原支架的制備方法可包括如下步驟：取剝離真皮后的牛皮膚，在1-4g/100ml的SDS水溶液中浸泡處理24-72h，然后用1-8％(體積分?jǐn)?shù))的TritonX-100水溶液浸泡處理24-72h，然后用含0.5-1.5mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液(25-100mmol/L、pH7.6-8.5)浸泡處理24-72h，用水清洗后凍干，即為膠原支架。所述膠原支架的制備方法具體可包括如下步驟：取剝離真皮后的牛皮膚，在3g/100ml的SDS水溶液中浸泡處理48h，然后用5％(體積分?jǐn)?shù))的TritonX-100水溶液浸泡處理48h，然后用含1mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液(50mmol/L、pH8.0)浸泡處理48h，用去離子水清洗后凍干，即為膠原支架。所述膠原支架的制備方法中還包括將制備得到的膠原支架進(jìn)行滅菌的步驟。所述滅菌的具體方法為：Co60照射滅菌。融合蛋白CBD-EphA4LBD具有很好的膠原特異結(jié)合能力，在有抑制劑存在時能促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)絲伸長。移植結(jié)合有CBD-EphA4LBD的膠原支架的大鼠在手術(shù)后三個月能相對空白對照組和單純膠原支架組表現(xiàn)出更好的神經(jīng)纖維和5-HT型神經(jīng)元的再生。結(jié)果表明，融合蛋白CBD-EphA4LBD具有很好的修復(fù)脊髓損傷的潛力和臨床應(yīng)用前景。本專利技術(shù)有利于解決脊髓再生抑制分子的拮抗蛋白在體內(nèi)擴(kuò)散造成的低活性和高風(fēng)險，為脊髓損傷的修復(fù)提供了新方法。附圖說明圖1為實施例2的結(jié)果。圖2為實施例3的結(jié)果。圖3為實施例4中手術(shù)及給藥的示意圖。圖4為實施例4中近頭側(cè)、近尾側(cè)和損傷區(qū)神經(jīng)絲蛋白特異標(biāo)志物NF的免疫熒光染色結(jié)果；標(biāo)尺為50μm，“Hoechst/GFAP/NF”為“細(xì)胞核熒光染料Hoechst/膠質(zhì)纖維酸性蛋白/神經(jīng)絲蛋白。圖5為實施例4中損傷區(qū)運動神經(jīng)元特異標(biāo)志物5-HT的免疫熒光染色結(jié)果；標(biāo)尺表示50μm，“Hoechst/GFAP/5-HT”為“細(xì)胞核熒光染料Hoechst/膠質(zhì)纖維酸性蛋白/酪氨酸羥化酶”。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術(shù)，但并不限定本專利技術(shù)。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。pET28a(+)載體:Novagen公司。大腸桿菌BL21(DE3)：北京全式金生物技術(shù)有限公司(貨號CD601-01)。anti-his：sigma(貨號H1029)。anti-mouseIgG(具有堿性磷酸酶標(biāo)記)：sigma(貨號A1418)。ephrinB3(髓鞘來源的抑制分子)：ProSpec公司(貨號PRO-497)。實施例中的PBS緩沖液均為pH7.4-7.6、0.01M的PBS緩沖液。來源于小鼠的anti-NF抗體：中杉金橋(貨號ZM-0198)。來源于小鼠的anti-5-HT抗體：Immunostar(貨號20080)。實施例1、融合蛋白CBD-EphA4LBD的制備一、重組質(zhì)粒pET28a-6his-CBD-EphA4LBD的構(gòu)建1、合成序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子。2、以步驟1得到的雙鏈DNA分子為模板，采用S1和X1組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。S1：5′－GCGAAGCTTGCGAAGTTACCTTATTGG－3′；X1：5′-CTCCTCGAGTCACTTTTTATAGAACACAC-3′；3、用限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、將pET28a(+)載體NdeI和BamHI酶切識別序列間的DNA片段替換為序列表的序列1自5’末端第64-84位核苷酸所示的DNA片段，得到重組質(zhì)粒pET28a-6his-CBD。5、用限制性內(nèi)切酶H本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種融合蛋白，包括CBD區(qū)段和EphA4LBD區(qū)段；所述CBD區(qū)段由序列表中序列2自氨基末端第22至28位氨基酸殘基組成；所述EphA4LBD區(qū)段由序列表中序列2自氨基末端第40至213位氨基酸殘基組成。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種融合蛋白，包括CBD區(qū)段和EphA4LBD區(qū)段；所述CBD區(qū)段由序列表中序列2自氨基末端第22至28位氨基酸殘基組成；所述EphA4LBD區(qū)段由序列表中序列2自氨基末端第40至213位氨基酸殘基組成。2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白中，所述CBD區(qū)段位于所述EphA4LBD區(qū)段的上游。3.如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白為如下(a)或(b)：(a)序列表中序列2自氨基末端第22至213位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。4.編碼權(quán)利要求1或2或3所述融合蛋白的基因。5.如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于：所述基因中，編碼所述CBD區(qū)段的DNA分子如序列表的序列1自5’末端第64至84位核苷酸所示，編碼所述EphA4LBD區(qū)段的DNA分子如序列表的序列1...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戴建武，李星，肖志峰，陳冰，趙燕南，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11