一種北五味子的擴繁方法技術

本發明專利技術涉及植物組培領域，特別涉及一種北五味子的擴繁方法，包括以下步驟：將消毒后的北五味子休眠芽暗培養，得到愈傷組織；將愈傷組織切割，培養得到胚性愈傷組織；將胚性愈傷組織進行生物反應器暗培養誘導體細胞胚，得到球形胚；進行體細胞胚的萌發培養，得到生根苗；生根苗移栽到珍珠巖和草炭重量比為1:2.8?3.2的基質培養基中，培養后進行移栽。本發明專利技術利用體細胞胚發生途徑獲得北五味子再生植株，實現了北五味子植株的快速擴繁，培養時間縮短，培養效率提高，可以大規模的獲得植株，有助于進行品種化生產；并且再生植株與母本具有高度一致性，遺傳穩定。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及植物組培領域，具體而言，涉及一種北五味子的擴繁方法。
技術介紹
北五味子是我國東北部名貴的道地藥材，主產于東北三省及內蒙、河北等地，其果實可以入藥，味酸、甘，性溫，具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心的功效。北五味子除藥用外，還可用于飲料和保健品，深受國內外消費者的青睞。隨著北五味子需求量逐步增加，北五味子的人工栽培面積急劇擴大，但由于目前育成的優良品系較少，野生五味子種子培育的實生苗生物學特性以及品質等群體間變異較大，豐產穩產性極差，良種繁育體系欠缺，嚴重制約了北五味子栽培業的發展。現有技術主要采用以下兩種方式進行繁殖：一、利用帶腋芽的嫩莖段進行組培快繁；但這種繁殖方式生根率極低并且叢生芽擴繁幾次后出現大面積死亡。二、利用種子無菌播種苗的下胚軸進行體細胞胚誘導；該方式存在以下缺陷：由種子產生的后代遺傳特性不穩定，不能夠遺傳母本優良品質。有鑒于此，特提出本專利技術。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種北五味子植株的擴繁方法，該方法通過胚性愈傷組織的擴繁和體細胞胚的誘導，可以縮短培養時間，提高培養效率；并且再生植株與母本具有高度一致性，遺傳穩定。為了實現本專利技術的上述目的，特采用以下技術方案：一種北五味子植株的擴繁方法，包括以下步驟：(a)、將消毒后的北五味子休眠芽放入誘導培養基進行暗培養，得到愈傷組織；(b)、將所述愈傷組織切割，然后放入誘導胚性愈傷組織培養基中進行培養，得到胚性愈傷組織；(c)、將所述胚性愈傷組織轉移到液體培養基中進行暗培養誘導體細胞胚，得到球形胚；(d)、將所述球形胚轉移到半固體培養基上進行體細胞胚的萌發培養，得到生根苗；(e)、將所述生根苗移栽到珍珠巖和草炭重量比為1:2.8-3.2的基質培養基中，培養后進行移栽；其中，所述誘導培養基的成分如下：MS培養基中含有2,4-D1.8-3.2mg/L、TDZ 0.15-0.25mg/L、蔗糖28-32g/L以及瓊脂6.5-7.5g/L，pH為5.7-6.0。本專利技術提供的一種北五味子植株的擴繁方法，先對北五味子的休眠芽誘導培養得到愈傷組織，誘導率為95％以上；然后將愈傷組織進行切割，進行胚性愈傷組織的誘導，胚性愈傷組織誘導得到的體細胞胚再進行萌發得到生根苗，即本專利技術利用體細胞胚發生途徑獲得北五味子再生植株，實現了北五味子植株的快速擴繁，培養時間縮短，培養效率提高，可以大規模的獲得植株，有助于進行品種化生產；并且再生植株與母本具有高度一致性，遺傳穩定。其中，誘導培養基中的2,4-D在MS培養基中的含量可以為1.8mg/L、2.2mg/L、2.5mg/L、3mg/L、3.2mg/L等等。優選地，在步驟(a)中，所述消毒為：取北五味子休眠芽體，先在自來水下沖洗，然后在超凈工作臺上用70％的酒精消毒28-35秒，再用0.1％升汞消毒18-22分鐘，最后用無菌水沖洗3-4次，剝去外鱗片即得所述消毒后的北五味子休眠芽。通過逐步的消毒，以得到無菌的并且無損傷的北五味子休眠芽，以便于下一步的誘導培養。外鱗片一般通過無菌的鑷子和刀片進行剝除。暗培養一般在盛有30-40ml誘導培養基的100ml的三角瓶進行，每個三角瓶中一般放置3-4個消毒的休眠芽，然后進行暗培養。為了暗培養得到的愈傷組織活力強，分化能力強，易于存活，優選地，在步驟(a)和步驟(c)中，所述暗培養的溫度為25±2℃，所述暗培養的時間為25-30天。本專利技術中，采用以上誘導培養基培養，一個休眠芽誘導得到的愈傷組織為0.5±0.025g。為了誘導胚性愈傷組織得到的胚性愈傷組織活力強，分化能力強，易于存活，優選地，在步驟(b)中，所述誘導胚性愈傷組織培養基的成分如下：MS培養基中含有2,4-D 2.8-3.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及瓊脂6.5-7.5g/L，pH為5.7-6.0。同樣地，優選地，在步驟(b)中，所述愈傷組織切割的大小為0.35-0.55cm×0.35-0.55cm，所述培養的時間為25-30天。本專利技術中，采用以上誘導胚性愈傷組織培養基培養，以每個休眠芽計，得到的胚性愈傷組織為0.2±0.01g。優選地，在步驟(c)中，所述液體培養基的成分如下：1/2濃度的MS培養基中含有蔗糖18-22g/L；所述暗培養的溫度為25±2℃，培養時間為40-45天。液體培養基培養是在氣升式生物反應器中進行，氣升式生物反應器的結構如圖1所示，具體地，包括依次連接的電源插頭1、氣泵2、空氣流量計3、過濾膜4、多孔噴嘴5、培養容器6、導管7、導管經過過濾膜4將氣體排出；圖1中箭頭方向指示氣體的進出方向。使用氣升式生物反應器對胚性愈傷組織進行暗培養誘導體細胞胚，在培養的過程中通過通入過濾過的空氣以滿足植物生長需求，空氣的通入量為0.2-0.3vvm，利用氣流所引起的液體不斷流動攪拌使植物組織能充分均勻的吸收營養物質，從而達到生長階段同步均一的效果，并且提高誘導率；另外，培養基不需要加入瓊脂，使生產成本降低60％；目前我們在用的最小的氣升式生物反應器為3L，與固體培養基(每瓶培養基為50mL)相比操作簡便，提高工作效率，節省勞動力成本。本專利技術中，采用以上液體培養基培養，以每個休眠芽計，得到的體細胞胚的個數為68±3個。優選地，在步驟(d)中，所述半固體培養基的成分如下：MS培養基中含有蔗糖28-32g/L，瓊脂6.5-7.5g/L，pH為5.7-6.0。經驗證，該培養基進行體細胞胚的萌發培養萌發率高，得到的生根苗更為健壯。本專利技術中，采用以上半固體培養基培養，以每個休眠芽計，得到的生根苗為34±2棵。為了便于移植，并提高存活率，得到的所述生根苗有3-4片葉。進一步地，在步驟(b)和(d)中，所述培養的條件為：培養溫度為25±2℃，光照時間為15-16小時/天。經驗證，步驟(b)和(d)以該培養條件進行培養，各組織能得到很好的生長。進一步地，在步驟(e)中，所述生根苗移栽前先用水沖洗掉培養基，然后移栽至盛有所述述基質培養基的容器中，然后用塑料袋將容器罩上，放在溫室內，溫室保持在25±2℃，光照時間為15-16小時/天。先進行套袋培養，以提高成活率，待該植株適應環境后，長出新葉，去掉塑料袋，進行移栽。本專利技術中，以每個休眠芽計，得到的可移栽苗為24-28棵。進一步地，所述北五味子的品種為嫣紅、早紅、金五味1號中的任一種。經驗證，以上品種的北五味子誘導得到的再生植株與母本性狀高度一致，且遺傳穩定。進一步地，步驟(b)中得到的胚性愈傷組織還包括：保存或繼代培養的步驟，然后再將得到的胚性愈傷組織進行后續步驟；其中，所述繼代培養或保存所用的培養基的成分為：MS培養基中含有2,4-D 0.8-2.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及瓊脂6-7g/L，pH為5.7-6.0。即本專利技術中得到的胚性愈傷組織可以直接進行后續的步驟，也可以直接進行繼代培養以使胚性愈傷組織進行擴繁和保存再進行后續的步驟。繼代培養和保存的條件均為：在溫度為25±2℃進行培養，光照時間為15小時/天，每28-35天繼代一次。經多次試驗，本專利技術采用繼代培養后得到的胚性愈傷組織仍具有擴繁和產生體細胞胚的能力，并且每次繼代培養的擴繁系數均為6倍以上，且對后續步驟基本無影響。并且已驗證繼代保存一年多仍具本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種北五味子植株的擴繁方法，其特征在于，包括以下步驟：(a)、將消毒后的北五味子休眠芽放入誘導培養基進行暗培養，得到愈傷組織；(b)、將所述愈傷組織切割，然后放入誘導胚性愈傷組織培養基中進行培養，得到胚性愈傷組織；(c)、將所述胚性愈傷組織轉移到液體培養基中進行暗培養誘導體細胞胚，得到球形胚；(d)、將所述球形胚轉移到半固體培養基上進行體細胞胚的萌發培養，得到生根苗；(e)、將所述生根苗移栽到珍珠巖和草炭重量比為1:2.8?3.2的基質培養基中，培養后進行移栽；其中，所述誘導培養基的成分如下：MS培養基中含有2,4?D1.8?3.2mg/L、TDZ?0.15?0.25mg/L、蔗糖28?32g/L以及瓊脂6.5?7.5g/L，pH為5.7?6.0。

【技術特征摘要】
1.一種北五味子植株的擴繁方法，其特征在于，包括以下步驟：(a)、將消毒后的北五味子休眠芽放入誘導培養基進行暗培養，得到愈傷組織；(b)、將所述愈傷組織切割，然后放入誘導胚性愈傷組織培養基中進行培養，得到胚性愈傷組織；(c)、將所述胚性愈傷組織轉移到液體培養基中進行暗培養誘導體細胞胚，得到球形胚；(d)、將所述球形胚轉移到半固體培養基上進行體細胞胚的萌發培養，得到生根苗；(e)、將所述生根苗移栽到珍珠巖和草炭重量比為1:2.8-3.2的基質培養基中，培養后進行移栽；其中，所述誘導培養基的成分如下：MS培養基中含有2,4-D1.8-3.2mg/L、TDZ 0.15-0.25mg/L、蔗糖28-32g/L以及瓊脂6.5-7.5g/L，pH為5.7-6.0。2.根據權利要求1所述的北五味子植株的擴繁方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述消毒為：取北五味子休眠芽體，先在自來水下沖洗，然后在超凈工作臺上用70％的酒精消毒28-35秒，再用0.1％升汞消毒18-22分鐘，最后用無菌水沖洗3-4次，剝去外鱗片即得所述消毒后的北五味子休眠芽。3.根據權利要求1所述的北五味子植株的擴繁方法，其特征在于，在步驟(a)和步驟(c)中，所述暗培養的溫度為25±2℃，所述暗培養的時間為25-30天。4.根據權利要求1所述的北五味子植株的擴繁方法，其特征在于，在步驟(b)中，所述誘導胚性愈傷組織培養基的成分如下：MS培養基中含有2,4-D 2.8-3.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及瓊脂6.5-7.5g/L，pH為5.7-6.0。5.根據權利要求4所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫丹，艾軍，王振興，秦紅艷，許培磊，趙瀅，范書田，楊義明，王春偉，
申請(專利權)人：中國農業科學院特產研究所，
類型：發明
國別省市：吉林;22