本發明專利技術公開了一種用于細胞成像的熒光核苷及其制備方法和應用。該類核苷熒光染料在RNA含量少的細胞區域和組織內具有較低的背景熒光，在RNA含量高的細胞區域和組織內具有較強的熒光信號，且當細胞的黏度發生變化是，熒光強度及壽命也隨之變化。由于網織紅細胞僅含有RNA,所以此類熒光分子能從血細胞中篩選出網織紅細胞，并對其進行多模式成像。這類化合物在水中具有一定溶解度，同時具有良好的水油兩親性，能穿過細胞膜；并且還具有較大的有效的雙光子吸收截面。此外，本發明專利技術的這類化合物還具有較低的生物毒性、光漂白性和高的光穩定性，且其光譜范圍與生物樣品的自身的光譜范圍有足夠大的差別。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一類熒光核苷的合成方法，具體涉及一種用于細胞成像的熒光核苷及其制備方法和應用。
技術介紹
近些年來，由于各種原因，心腦血管疾病的發病率越來越高，且逐漸年輕化。心腦血管疾病具有“發病率高、致殘率高、死亡率高、復發率高,并發癥多”等特點。目前，全世界每年死于心腦血管疾病的人數高達1500萬人，居各種死因首位。血黏度升高，導致人體新陳代謝速度減慢，血液流速會減慢，造成心腦供血不足進而引發冠心病、高血壓、腦血栓等心腦血管疾病。所以建立一種簡便的、快捷的、高效的、靈敏的血液黏度檢測技術是預防和檢測心腦血管疾病的一項重要的工作。對于宏觀的大體積的黏稠流體的黏度測試方法是利用黏度計。但是，對于微環境(尤其是細胞內或生物組織內的黏度，利用黏度儀是不能實現其黏度的測定。目前，已經報道的年度轉子主要有：熒光強度黏度轉子、比例熒光黏度轉子、熒光壽命年度轉子、熒光比例和壽命雙模式黏度轉子。然而，這些轉子都不能在網織紅細胞甚至紅細胞內成像和檢測黏度。隨著雙光子技術的發展，雙光子激光共聚焦顯微成像在生命科學的研究中已經成為最重要的成像技術。與傳統的單光子激光共聚焦顯微成像相比，激光共聚焦顯微成像具有明顯優勢，包括近紅外激發、暗場成像、避免熒光漂白和光致毒、定靶激發、高橫向分辨率與縱向分辨率、降低生物組織吸光系數及降低組織自發熒光干擾等(Helmchen F,Svoboda K,Denk W et al.Nature 1999,2,989-996.Zhang,H.；Fan,J.L.；Wang,J.Y.；Zhang,S.Z.；Dou,B.R.；Peng,X.J.J.Am.Chem.Soc.2013,135,11663-11669.Zhang,H.；Fan,J.L.；Wang,K.；Li,J.；Wang,C.X.；Nie,Y.M.；Jiang,T.；Mu,H.Y.；Peng,X.J.；Jiang,K.Anal.Chem.2014,86,9131-9138)，因此雙光子顯微成像技術使生物成像研究進入了一個嶄新的階段。而對網織紅細胞成像及其黏度變化的檢測的專一性多模式成像的熒光核苷還尚未有人報道，開發專一性好的篩選網織紅細胞及檢測其粘度變化的熒光核苷是一個開創性的工作。
技術實現思路
為了解決現有技術的不足，本專利技術提供了一種用于細胞成像的熒光核苷及其制備方法和應用。本專利技術的技術方案是：一種用于細胞成像的熒光核苷，所述熒光核苷具有通式I結構：其中：B選自dA、dG、dC、dT或dU，其中R7獨立選自烷基鏈、-H、-TBDMS、-Boc、-Ac或-DMTr；R1選自-Ph、-Ph(CH3)n、-Ph(CH2CH3)n、-Ph((OCH2CH2)nOCH3)m、-Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)m,-Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)2或-PhN((OCH2CH2CH2)nOCH3)2,其中n選自1-8的整數；m選擇1-3的整數；R2、R3、R4、R5各自獨立地選自-CH3或-(CH2)nCH3，其中n選自1-8的整數；R6獨立地選自-N(CH3)2或-N(CH2)nCH3，其中n選自1-8的整數；，其中n選自1-3的整數；L選自烷基鏈、-Ph-、-CH2-(CH＝CH)n-(C≡C)m-CH2-、-(CH2)nCH＝CH(CH2)n-或-(CH2)nC≡C(CH2)n-,其中n，m獨立選自0-4的整數。作為本專利技術的進一步改進包括：所述的熒光核苷，選自下列化合物：本專利技術的另一目的在于提供了一種制備上述的熒光核苷的方法，包括以下步驟：)化合物a與三甲基硅基乙炔按照摩爾比1:1-1:6反應，制備化合物b:反應溫度為0-50℃，Pd、Cu和胺同時催化，反應時間為6-24小時，反應溶劑選自二氯甲烷、四氫呋喃、乙醚或二惡烷中的至少一種；2)化合物b與四丁基氟化銨按照摩爾比1:0.8-1:4反應，制備化合物c：反應溫度為0-50℃，反應時間為10min-5h，反應溶劑選自二氯甲烷、四氫呋喃、乙醚或二惡烷中的至少一種；3)將步驟1)或2)中制備得到的化合物b或c,分別與步驟化合物dAI按照摩爾比1:1-3反應，制備化合物dABp-1-dABp-4：反應溫度為0-50℃，Pd、Cu和胺同時催化，反應時間為8-24h，反應溶劑選自二氯甲烷、四氫呋喃、乙醚或二惡烷中的至少一種。上述的熒光核苷在生物成像中的應用。所述的熒光核苷在生物成像中的應用，其生物樣品是包括血細胞或網織紅細胞在內的活細胞。本專利技術改進現有的黏度熒光核苷在應用的不足，設計并合成出雙光子激發、適用于有效的、專一的識別含有RNA的網織紅細胞(在血細胞中)及檢測細胞粘度的并對其成像的熒光核苷。該類核苷熒光染料在RNA含量少的細胞區域和組織內具有較低的背景熒光，在RNA含量高的細胞區域和組織內具有較強的熒光信號，且當細胞的黏度發生變化是，熒光強度及壽命也隨之變化。由于網織紅細胞僅含有RNA,所以此類熒光分子能從血細胞中篩選出網織紅細胞，并對其進行多模式成像。這類化合物在水中具有一定溶解度，同時具有良好的水油兩親性，能穿過細胞膜；并且還具有較大的有效的雙光子吸收截面。此外，本專利技術的這類化合物還具有較低的生物毒性、光漂白性和高的光穩定性，且其光譜范圍與生物樣品的自身的光譜范圍有足夠大的差別。本專利技術所述的熒光核苷具備以下優點：所述化合物引入了專一性識別和定位基團，提高了對細胞和組織識別的專一性、特異性；所述化合物具有良好的雙光子性能，應用于生物樣品成像時具有低的生物光漂白、光損傷和生物毒性；所述化合物部分分子的熒光發射波長較長，可用于活細胞成像；所述化合物均可作為比例和壽命熒光核苷對網織紅細胞進行成像，排除環境因素對熒光強度的干擾；所述化合物毒副性小，原料易得，結構簡單，易制備，易產業化。附圖說明圖1是實施例2表征本專利技術的熒光核苷化合物dABp-1對黏度的響應。測定方法為：將化合物dABp-1分別加入到水和甘油的不同比例的混合溶液中，測定熒光發射光譜。圖2是實施例3表征本專利技術的熒光核苷化合物dABp-1在不同黏度下的熒光壽命的變化。測定方法為：將化合物dABp-1分別加入到水和甘油的不同比例的混合溶液中，測定熒光壽命。圖3是實施例4表征本專利技術的熒光核苷化合物dABp-1在網織紅細胞中不同成像模式下的成像圖片。測定方法為：將10μL濃度為1mM的dABp-1的DMSO溶液加入到的網織紅細胞中，在37℃，5％CO2下孵育50分鐘，選取某一區域，用油鏡(60×)觀察，重復三次。圖片收集波長490-520nm,550-580nm。圖4是實施例6表征本專利技術的熒光核苷化合物dABp-2的水溶解性。測試方法：用不同濃度的dABp-2的水溶液，測試其在最大吸收下的熒光發射強度。圖5是實施例7表征本專利技術的熒光核苷化合物dABp-2對細胞黏度的響應。測試方法：將10μL濃度為1mM的dABp-1的DMSO溶液加入到的HepG 2細胞中，在37℃，5％CO2下孵育30分鐘，選取某一區域，分別在25℃和37℃下，用油鏡(60×)觀察、拍照，重復三次。圖片收集波長490-520nm,550-580nm。圖6是實施例8表征本專利技術的熒光核苷化合物dABp-3的生物毒性測試。測試方法：將不同濃度梯度的dA本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于細胞成像的熒光核苷，其特征在于，所述熒光核苷具有通式I結構：其中：B選自dA、dG、dC、dT或dU，其中R7獨立選自烷基鏈、?H、?TBDMS、?Boc、?Ac或?DMTr；R1選自?Ph、?Ph(CH3)n、?Ph(CH2CH3)n、?Ph((OCH2CH2)nOCH3)m、?Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)m,?Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)2或?PhN((OCH2CH2CH2)nOCH3)2,其中n選自1?8的整數；m選擇1?3的整數；R2、R3、R4、R5各自獨立地選自?CH3或?(CH2)nCH3，其中n選自1?8的整數；R6獨立地選自?N(CH3)2或?N(CH2)nCH3，其中n選自1?8的整數；其中n選自1?3的整數；L選自烷基鏈、?Ph?、?CH2?(CH＝CH)n?(C≡C)m?CH2?、?(CH2)nCH＝CH(CH2)n?或?(CH2)nC≡C(CH2)n?,其中n，m獨立選自0?4的整數。
【技術特征摘要】
2016.03.11 CN 20161013788251.一種用于細胞成像的熒光核苷，其特征在于，所述熒光核苷具有通式I結構：其中：B選自dA、dG、dC、dT或dU，其中R7獨立選自烷基鏈、-H、-TBDMS、-Boc、-Ac或-DMTr；R1選自-Ph、-Ph(CH3)n、-Ph(CH2CH3)n、-Ph((OCH2CH2)nOCH3)m、-Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)m,-Ph((OCH2CH2CH2)nOCH3)2或-PhN((OCH2CH2CH2)nOCH3)2,其中n選自1-8的整數；m選擇1-3的整數；R2、R3、R4、R5各自獨立地選自-CH3或-(CH2)nCH3，其中n選自1-8的整數；R6獨立地選自-N(CH3)2或-N(CH2)nCH3，其中n選自1-8的整數；其中n選自1-3的整數；L選自烷基鏈、-Ph-、-CH2-(CH＝CH)n-(C≡C)m-CH2-、-(CH2)nCH＝CH(CH2)n-或-(CH2)nC≡C(CH2)n-,其中n，m獨立選自0-4...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭海明，張言言，仉華，李建平，謝明勝，渠桂榮，
申請(專利權)人：河南師范大學，
類型：發明
國別省市：河南;41
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