本發明專利技術涉及一種基于微細加工技術實現的單細胞捕獲并定位培養芯片及其使用和制備方法，屬于生物微機電系統(Bio?MEMS)領域。該芯片由細胞定位培養層與玻片層組成，所述的細胞定位培養結構層包含有進樣口1、出樣口8、以及兩者之間的若干細胞定位培養單元。使用時先從進樣口1加入細胞懸液，細胞隨流體進入陣列中的捕獲區域3；再從出樣口7加入不含細胞的培養液，被捕獲的細胞受流體推力，沿通道進入細胞培養區域5，待細胞在培養結構中貼壁培養。本發明專利技術解決了細胞捕捉所需要的小空間以及細胞培養鋪展所需要的大空間之間的矛盾，在一個芯片上集成了細胞捕獲區域與細胞培養區域，既可以精準的捕獲細胞得到較高的單細胞率，又可以給單個細胞提供足夠的鋪展空間使其貼壁生長。
【技術實現步驟摘要】
所屬領域本專利技術涉及一種基于微細加工技術實現的單細胞捕獲并定位培養芯片及其使用和制備方法，屬于生物微機電系統(Bio-MEMS)領域。
技術介紹
單細胞定位培養芯片作為貼壁依賴型細胞研究及行為控制的實驗性工具，使人們能夠更加清晰地認識到細胞群中每個細胞的本質區別、了解細胞間的相互作用力及信號傳導、分析單個細胞如何相互作用形成組織和器官，進而從單細胞層面理解各種生命現象。因此在細胞生物學、藥物檢測，生物傳感器以及疾病診斷等等領域具有廣闊的應用前景。傳統的用微細加工技術實現細胞定位培養有兩種方案，一種是通過對培養基底表面進行修飾，形成細胞貼附生長的指定的區域，使細胞選擇性地貼附生長形成細胞圖型；另一種方法是通過可移除的物理阻隔層將細胞限制在特定的區域生長。通過進行表面化學修飾的細胞培養芯片穩定性不足，實驗結果的可重復性不足。Ching-Hui Lin等人(C.Lin,Y.Hsiao,H.Chang,C.Yeh,C.He,E.M.Salm,C.Chen,I.Chiu and C.Hsu,Lab Chip,2015,DOI:10.1039/C5LC00541H.)借助微流控技術，設計了兩片PDMS芯片，其中一片是較小的孔陣列用于細胞捕獲，另一層是較大的孔陣列，用于細胞培養。這種實現細胞捕獲的方法能夠實現單細胞的捕獲，并能提供細胞生長所需的鋪展空間。然而它是由兩片PDMS構成，大孔陣列與小孔陣列的對準與鍵合具有一定的難度。因此本專利技術旨在解決這一問題。
技術實現思路
本專利技術的目的是：為了解決現有的單細胞捕獲和培養芯片對準和鍵合困難的問題，本專利技術提供了一種基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片。本專利技術的技術方案是：一種基于單細胞捕獲實現細胞定位培養芯片由細胞定位培養層與玻片層組成，該細胞定位培養層可由任何適合培養生物細胞的生物相容材料制成；所述的細胞定位培養結構層包含有進樣口1、出樣口8、以及兩者之間的若干細胞定位培養單元；所述細胞定位培養單元由捕獲區域3與培養區域4組成；所述捕獲區域3是由結構外壁7內側構成的U形腔體以及攔截微柱6組成，細胞捕獲結構開口由兩結構外壁7構成，其寬度尺寸d1：d0<d1<2d0，其中d0為待培養細胞的直徑；所述攔截微柱6與左右側壁的距離小于d0且攔截微柱寬d2：d0/2<d2<d1；其中攔截入口為兩結構外壁7捕獲區域3構成的結構，反向入口為兩結構外壁7在培養區域構成的與攔截入口相對的結構，其中任一個培養單元的攔截入口應當與細胞通道5、另外一個培養單元的反向入口有對齊關系；培養區域3是由結構外壁內側形成的腔體，該腔體邊長d3：30μm<d3<200μm；相鄰的兩個結構外壁7外側構成細胞通道 5；流體反向入口寬為d1；所述細胞定位培養單元寬度為D；d3+20μm<D<d3+40μm；陣列橫向間距為w1：D+d1<w1<D+2d1；整列縱向間距為w2：2d1+d3<w2<2d1+d3+100；更優方案:根據實驗結果提出優化方案：1.結構外壁輪廓設計為帶傾角或圓角的結構更加符合仿真結果，有利于液體流動。2.加厚結構外壁壁厚有利于牢固的鍵合。3.設計為兩個進樣口1以及兩個出樣口8有利于芯片內部穩態。所述基于單細胞捕獲的一體式細胞定位芯片的使用方法包括以下步驟：步驟一：從進樣口1加入細胞懸液，則細胞被捕獲區域3攔截。步驟二：從進樣口1加入培養液或緩沖液，將未被捕獲的細胞沖走。步驟三：從出樣口8反向加入培養液或緩沖液，將被捕獲的細胞沖到細胞培養區域4，待細胞在培養結構中貼壁培養。本專利技術還公開了細胞定位培養層材料為聚合物的所述基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片的制備方法，采用MEMS技術和復制模塑技術完成完成，具體包括如下步驟：步驟一：準備聚合物材料；步驟二：將聚合物澆注在硅模板上，并靜置；所述硅模板包括如下子步驟：子步驟一：涂光刻膠，進行曝光，顯影，將刻蝕結構從掩膜板轉移到光刻膠上；子步驟二：對有光刻膠結構的硅片進行ICP刻蝕；子步驟三：丙酮去除光刻膠。步驟三：將聚合物從硅模板剝下，得到所述具有單細胞捕獲及培養結構的聚合物基片；步驟四：將聚合物基片與載玻片進行鍵合，形成微通道；步驟五：在通道出入口的位置上外接流體管道，完成芯片制備。本專利技術的有益效果是：專利技術提出了一種基于單細胞捕獲實現細胞定位培養芯片及其使用和制備方法。該芯片解決了細胞捕捉所需要的小空間以及細胞培養鋪展所需要的大空間之間的矛盾，在一個芯片上集成了細胞捕獲區域與細胞培養區域，既可以精準的捕獲細胞得到較高的單細胞率，又可以給單個細胞提供足夠的鋪展空間使其貼壁生長。其次，相較于傳統的雙層芯片，本專利技術解決了鍵合對準的問題，制備工藝簡單，使用步驟簡化。附圖說明圖1為本專利技術提出的基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片效果圖圖2為本專利技術提出的基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片的陣列結構設計圖圖3為本專利技術的基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片的硅模板加工工藝路線圖4為本專利技術提出的基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片的制作工藝路線圖中：1.進樣口，2.細胞，3.捕獲區域，4.培養區域，5.細胞通道，6攔截微柱，7.結構外壁，8.出樣口具體實施方式實施例1：本實施例中的芯片用于培養成纖維細胞L929來進行細胞定位培養研究。L929在懸浮液中平均直徑d0為10μm。參閱圖1～圖3。本實施例中將基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片用于單個L929細胞培養。其中，基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片的結構尺寸如下：細胞捕獲區域3的尺寸捕捉入口d1＝15μm；攔截微柱寬度d2＝5μm；培養區域邊長d3＝50μm；D＝70μm；相鄰兩個結構陣列橫向間距w1＝90μm；相鄰兩個結構陣列縱向間距w2＝100μm；w3＝15μm；刻蝕深度h＝15μm。本實施例中基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片，采用MEMS技術和復制模塑技術完成，具體包括如下步驟：步驟一：按質量為10:1混合PDMS預聚體和交聯劑，并充分攪拌均勻后，放入真空干燥箱中脫氣30分鐘，直至混合過程中產生的氣泡完全排除；步驟二：將PDMS澆注在硅模板上，并靜置；所述硅模板包括如下子步驟：子步驟一：制作掩模版；子步驟二：光刻；子步驟三：電感耦合等離子體反應刻蝕，刻蝕深度為15μm；子步驟四：丙酮去除光刻膠；子步驟五：鈍化1min。步驟三：將澆注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS發生交聯反應而固化，固化參數為：固化溫度80℃，固化時間1h；將冷卻后的PDMS輕輕剝下，就得到了所述基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片的基片；切片并打孔；步驟四：用電暈放電儀將PDMS基片與載玻片表面改性處理30s后，進行鍵合；步驟五：將毛細管接入芯片出入口即可得到所需基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片。實施例2：本實施例中的芯片用于培養人乳腺上皮細胞HMEC來單細胞捕獲及定位培養研究。HMEC在懸浮狀態平均直徑d0＝10μm。參閱圖1～圖3。本實施例中將基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片用于單個 HMEC細胞培養。其中，基于單細胞捕獲的一體式細胞定位培養芯片的結構尺寸如下：細胞捕獲區域3的尺寸攔截入口d1＝15μm本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于單細胞捕獲實現細胞定位培養芯片，其特征在于，由細胞定位培養層與玻片層，所述細胞定位培養層由生物相容材料制成；所述的細胞定位培養結構層包含有進樣口1、出樣口8、以及兩者之間的若干細胞定位培養單元；所述細胞定位培養單元由捕獲區域3與培養區域4組成；所述捕獲區域3是由結構外壁7內側構成的U形腔體以及攔截微柱6組成，細胞捕獲結構開口由兩結構外壁7構成，其寬度尺寸d1：d0<d1<2d0，其中d0為待培養細胞的直徑；所述攔截微柱6與左右側壁的距離小于d0且攔截微柱寬d2：d0/2<d2<d1；其中攔截入口為兩結構外壁7捕獲區域3構成的結構，反向入口為兩結構外壁7在培養區域構成的與攔截入口相對的結構，其中任一個培養單元的攔截入口應當與細胞通道5、另外一個培養單元的反向入口有對齊關系；培養區域3是由結構外壁內側形成的腔體，該腔體邊長d3：30μm<d3<200μm；相鄰的兩個結構外壁7外側構成細胞通道5；流體反向入口寬為d1；所述細胞定位培養單元寬度為D；d3+20μm<D<d3+40μm；陣列橫向間距為w1：D+d1<w1<D+2d1；整列縱向間距為w2：2d1+d3<w2<2d1+d3+100。...
【技術特征摘要】
1.一種基于單細胞捕獲實現細胞定位培養芯片，其特征在于，由細胞定位培養層與玻片層，所述細胞定位培養層由生物相容材料制成；所述的細胞定位培養結構層包含有進樣口1、出樣口8、以及兩者之間的若干細胞定位培養單元；所述細胞定位培養單元由捕獲區域3與培養區域4組成；所述捕獲區域3是由結構外壁7內側構成的U形腔體以及攔截微柱6組成，細胞捕獲結構開口由兩結構外壁7構成，其寬度尺寸d1：d0<d1<2d0，其中d0為待培養細胞的直徑；所述攔截微柱6與左右側壁的距離小于d0且攔截微柱寬d2：d0/2<d2<d1；其中攔截入口為兩結構外壁7捕獲區域3構成的結構，反向入口為兩結構外壁7在培養區域構成的與攔截入口相對的結構，其中任一個培養單元的攔截入口應當與細胞通道5、另外一個培養單元的反向入口有對齊關系；培養區域3是由結構外壁內側形成的腔體，該腔體邊長d3：30μm<d3<200μm；相鄰的兩個結構外壁7外側構成細胞通道5；流體反向入口寬為d1；所述細胞定位培養單元寬度為D；d3+20μm<D<d3+40μm；陣列橫向間距為w1：D+d1<w1<D+2d1；整列縱向間距為w2：2d1+d3<w2<2d1+d3+100。2.一種如權利要求1所述的基于單細胞捕獲實現...
【專利技術屬性】
技術研發人員：葉芳，謝晉，何美瑩，騫愛榮，常洪龍，
申請(專利權)人：西北工業大學，
類型：發明
國別省市：陜西;61
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