本實(shí)用新型專利技術(shù)公開(kāi)了一種微片式單細(xì)胞克隆分離培養(yǎng)板，培養(yǎng)板包括培養(yǎng)板本體，所述培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有若干方形培養(yǎng)孔，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)放置若干呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片，本實(shí)用新型專利技術(shù)所述方形培養(yǎng)孔的底面和四壁、以及方形培養(yǎng)片的底面、周緣、凸起及頂面的周邊均覆蓋有超疏水納米層，細(xì)胞只能在方形培養(yǎng)片的上表面經(jīng)過(guò)親水改性的中心區(qū)粘附生長(zhǎng)，而不能在覆蓋有超疏水納米層其它部位粘附生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)有限稀釋的細(xì)胞粘附于方形培養(yǎng)片的上表面經(jīng)過(guò)親水改性的中心區(qū)后，只要每個(gè)方形培養(yǎng)片只有一個(gè)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，即可根據(jù)編號(hào)，用鑷子夾住相應(yīng)方形培養(yǎng)片的凸起，可方便的進(jìn)行單細(xì)胞克隆的分離操作。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本技術(shù)涉及單細(xì)胞克隆的培養(yǎng)分離，特別涉及一種微片式單細(xì)胞克隆分離培養(yǎng)板及單細(xì)胞克隆分離方法。
技術(shù)介紹
單細(xì)胞克隆指的是分離單個(gè)細(xì)胞，其增殖產(chǎn)生的后代都是來(lái)源于同一個(gè)細(xì)胞，即為單細(xì)胞克隆。傳統(tǒng)的單細(xì)胞克隆分離可采用有限稀釋法或克隆環(huán)法。有限稀釋法:即把細(xì)胞稀釋到理論上的5~10 μ I培養(yǎng)液中含I個(gè)細(xì)胞，然后用移液器吸取相應(yīng)容積的細(xì)胞懸液至96孔板中，每孔補(bǔ)足培養(yǎng)液至200 μ 1，在顯微鏡下找到有單細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，進(jìn)行單細(xì)胞克隆分離。實(shí)際的操作中，該法效率不高，大量存在的空白孔和多細(xì)胞孔(細(xì)胞數(shù)大于或等于2)需要研宄人員觀察排除，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。克隆環(huán)法:在顯微鏡下找到要挑取的單克隆，用記號(hào)筆在培養(yǎng)板的背面標(biāo)示出來(lái)。用鑷子夾取克隆環(huán)，在環(huán)的底部均勻的涂上凡士林，扣在標(biāo)記的單克隆上，形成相對(duì)封閉的空間，然后在克隆環(huán)內(nèi)滴入適量的胰酶，細(xì)胞消化下來(lái)后用槍頭吸出，放到新的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。該方法對(duì)操作技巧要求較高，初學(xué)者不易掌握。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為克服上述現(xiàn)有方法的缺陷與不足，本技術(shù)提供一種微片式單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)板及單細(xì)胞克隆分離方法。本技術(shù)的技術(shù)方案是:一種微片式單細(xì)胞克隆分離培養(yǎng)板，包括培養(yǎng)板本體，所述培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有若干方形培養(yǎng)孔，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)放置若干呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片，培養(yǎng)板本體上方蓋有培養(yǎng)板蓋。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)板本體為聚苯乙烯板。優(yōu)選的，所述方形培養(yǎng)片上表面邊角處設(shè)有凸起。優(yōu)選的，所述方形培養(yǎng)片的上表面中心區(qū)為細(xì)胞貼壁培養(yǎng)區(qū)，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)區(qū)聚苯乙烯表面進(jìn)行過(guò)改性處理，接枝羥基、羧基或氨基等親水基團(tuán)。優(yōu)選的，所述方形培養(yǎng)孔的底面和四壁以及方形培養(yǎng)片的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)區(qū)以外的表面覆蓋有超疏水納米層。優(yōu)選的，所述超疏水納米層為具有超疏水表面的聚苯乙稀層、聚L-乳酸層、聚四氟乙烯層、陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜中的一種。優(yōu)選的，所述方形培養(yǎng)片底面標(biāo)有字母和數(shù)字組成的組合編號(hào)。一種使用微片式單細(xì)胞克隆分離培養(yǎng)板進(jìn)行單細(xì)胞克隆分離的方法，包括步驟:S1、將細(xì)胞懸液濃度稀釋至30~50 cells/ml，在培養(yǎng)板的方形培養(yǎng)孔內(nèi)加入定量的細(xì)胞稀釋液，細(xì)胞只能在方形培養(yǎng)片上表面的經(jīng)過(guò)表面親水改性處理的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)區(qū)粘附生長(zhǎng)，而不能在其它經(jīng)過(guò)超疏水處理的部位粘附生長(zhǎng)；S2、每天在顯微鏡下觀察方形培養(yǎng)片內(nèi)的細(xì)胞，選擇有單細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的方形培養(yǎng)片，根據(jù)其編號(hào)，用鑷子夾起方形培養(yǎng)片上的凸起，無(wú)菌轉(zhuǎn)移至24孔板的培養(yǎng)孔中；S3、將生長(zhǎng)有單細(xì)胞克隆的方形培養(yǎng)片依次在3個(gè)培養(yǎng)孔中用PBS輕柔漂洗3次，轉(zhuǎn)移至第四個(gè)孔中，加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞；S4、收集消化好的單細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS重懸，在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細(xì)胞沉淀，再次在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細(xì)胞沉淀，用完全培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，所得即為單細(xì)胞克隆。優(yōu)選的，所述方形培養(yǎng)片預(yù)先通過(guò)可溶性生物材料粘附在方形培養(yǎng)孔內(nèi)，可溶性生物材料在加入培養(yǎng)液后可溶解，使方形培養(yǎng)片與方形培養(yǎng)孔分開(kāi)。優(yōu)選的，所述可溶性生物材料包括膠原、牛血清白蛋白、人血白蛋白、胎牛血清蛋白和小牛血清蛋白。本技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是:本技術(shù)所述的微片式單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)板及單細(xì)胞克隆分離方法，培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有若干個(gè)方形培養(yǎng)孔，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)放置呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片，所述方形培養(yǎng)孔的底面和四壁、以及方形培養(yǎng)片的底面、周緣、凸起及頂面的周邊均覆蓋有超疏水納米層，細(xì)胞只能在方形培養(yǎng)片的上表面經(jīng)過(guò)親水改性的中心區(qū)粘附生長(zhǎng)，而不能在覆蓋有超疏水納米層其它部位粘附生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)有限稀釋的細(xì)胞粘附于方形培養(yǎng)片的上表面經(jīng)過(guò)親水改性的中心區(qū)后，只要每個(gè)方形培養(yǎng)片只有一個(gè)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，即可根據(jù)編號(hào)，用鑷子夾住相應(yīng)方形培養(yǎng)片的凸起，可方便的進(jìn)行單細(xì)胞克隆的分離操作。【附圖說(shuō)明】下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本技術(shù)作進(jìn)一步描述:圖1為本技術(shù)所述的微片式單細(xì)胞克隆分離培養(yǎng)板的培養(yǎng)板本體的俯視圖；圖2為本技術(shù)所述的方形培養(yǎng)片的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本技術(shù)所述的方形培養(yǎng)片的俯視結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為本技術(shù)所述的微片式單細(xì)胞克隆分離培養(yǎng)板蓋上培養(yǎng)板蓋的整體結(jié)構(gòu)示意圖。【具體實(shí)施方式】如圖1和4所示，本技術(shù)所揭示的微片式單細(xì)胞克隆分離培養(yǎng)板，包括由聚苯乙烯制成的培養(yǎng)板本體I，所述培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有6個(gè)方形培養(yǎng)孔2，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)放置1X 10 (方形培養(yǎng)片的矩陣排列方式也可以為7X7、8X8、9X9或其它組合方式)呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片3，培養(yǎng)板本體上方蓋有培養(yǎng)板蓋4。如圖2和3所示，所述方形培養(yǎng)片3上表面右上方的邊角設(shè)有凸起31，方便用鑷子夾起，方形培養(yǎng)片底面標(biāo)有字母和數(shù)字組成的組合編號(hào)，字母代表該方形培養(yǎng)片所在行，數(shù)字代表該方形培養(yǎng)片所在列，方便區(qū)分。所述方形培養(yǎng)片的上表面中心區(qū)為細(xì)胞貼壁培養(yǎng)區(qū)32，將細(xì)胞貼壁培養(yǎng)區(qū)聚苯乙烯表面進(jìn)行改性處理，接枝羥基(OH)，或者羧基(COOH)，或者氨基(NH或NH2)等親水基團(tuán)。所述方形培養(yǎng)片除上表面中心區(qū)為細(xì)胞貼壁培養(yǎng)區(qū)外，其它部位的聚苯乙烯區(qū)表面覆蓋有超疏水納米層。超疏水納米層為具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料，超疏水納米層還可以為超疏水的陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜，上述超疏水納米層的制作方法為現(xiàn)有技術(shù)采用的方法，例如在聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料表面蝕刻具有一定粗糙度的微觀結(jié)構(gòu)從而構(gòu)建超疏水表面，采用氣相沉積的方法制備超疏水的陣列碳納米管薄膜或氟化PEDOT薄膜。本技術(shù)的使用微片式單細(xì)胞克隆分離專用培養(yǎng)板進(jìn)行單細(xì)胞克隆分離的方法，包括步驟:S1、將細(xì)胞懸液濃度稀釋至30~50 cells/ml，在培養(yǎng)板的方形培養(yǎng)孔內(nèi)加入2 ml的細(xì)胞稀釋液，細(xì)胞只能在方形培養(yǎng)片上表面的經(jīng)過(guò)表面親水改性處理的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)區(qū)粘附生長(zhǎng)，而不能在其它經(jīng)過(guò)超疏水處理的部位粘附生長(zhǎng)；S2、每天在顯微鏡下觀察方形培養(yǎng)片內(nèi)的細(xì)胞，選擇有單細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的方形培養(yǎng)片，根據(jù)其編號(hào)，用鑷子夾起方形培養(yǎng)片上的凸起，無(wú)菌轉(zhuǎn)移至24孔板的培養(yǎng)孔中；S3、將生長(zhǎng)有單細(xì)胞克隆的方形培養(yǎng)片依次在3個(gè)培養(yǎng)孔中用PBS輕柔漂洗3次，轉(zhuǎn)移至第四個(gè)孔中，加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞；S4、收集消化好的單細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS重懸，在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細(xì)胞沉淀，再次在100rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，獲取細(xì)胞沉淀，用完全培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的24孔中，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，所得即為單細(xì)胞克隆。所述方形培養(yǎng)片預(yù)先通過(guò)可溶性生物材料粘附在方形培養(yǎng)孔內(nèi)，可溶性生物材料在加入培養(yǎng)液后可溶解，使方形培養(yǎng)片與方形培養(yǎng)孔分開(kāi)。所述可溶性生物材料包括膠原、牛血清白蛋白、人血白蛋白、胎牛血清蛋白和小牛血清蛋白。上述實(shí)施例只為說(shuō)明本技術(shù)的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人能夠了解本技術(shù)的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本技術(shù)的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本技術(shù)主要技術(shù)方案的精神實(shí)質(zhì)所做的修飾，都應(yīng)涵蓋在本技術(shù)的保護(hù)范圍之內(nèi)。【主權(quán)項(xiàng)】1.一種微片式單細(xì)胞克隆分離培養(yǎng)板，其特征在于:包括培養(yǎng)板本體，所述培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有若干方形培養(yǎng)孔，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)放置若干呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片，培養(yǎng)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種微片式單細(xì)胞克隆分離培養(yǎng)板，其特征在于：包括培養(yǎng)板本體，所述培養(yǎng)板本體上表面設(shè)有若干方形培養(yǎng)孔，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)放置若干呈矩陣排列的方形培養(yǎng)片，培養(yǎng)板本體上方蓋有培養(yǎng)板蓋。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何向鋒，施文，王建紅，強(qiáng)福林，沈康，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：何向鋒，南通市腫瘤醫(yī)院，
類型：新型
國(guó)別省市：江蘇;32
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