本發明專利技術提供了一種體外構建具有抗流動剪切和抗血小板凝集功能的血管內皮層的方法，通過對人造血管內腔表面的血管內皮細胞施加緩慢地，逐漸增加的流動剪切力，使血管內皮細胞逐步適應剪切力環境，該方法主要包含以下步驟：將內腔表面長滿血管內皮細胞的人造血管連接到剪切力誘導系統的管路中；啟動剪切力誘導系統的液體驅動泵，使內皮細胞受到的初始剪切力為0-2dyne/cm2；每隔一段時間，調節液體驅動泵，使內皮細胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例；直到內皮細胞受到的剪切力達到移植部位動脈血管內皮細胞所承受的平均或峰值剪切力水平為止；將剪切力保持在移植部位動脈血管內皮細胞所承受的平均或峰值剪切力水平，培養內皮細胞24-72小時。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細胞培養、組織工程領域，更具體地涉及一種體外構建具有抗生理大小的流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內皮層的方法。
技術介紹
用組織工程方法體外構建小口徑人造血管植入物是解決臨床上小口徑血管移植物來源不足的重要途徑。但是目前小口徑人造血管還不能應用于臨床，一個重要原因是小口徑人造血管移植后容易發生血小板凝集導致的急性血栓和遠期的移植部位的再狹窄，這些問題都是由于小口徑血管移植物內表面缺乏完整的、有功能的內皮細胞層造成的。體內的完整的血管內皮細胞層具有抗血小板凝集、抗炎癥、抗動脈硬化的功能，對于維持血管的正常生理功能有重要作用。為此小口徑人造血管構建過程中采用了多種方法提高內皮細胞在人造血管內表面的留存。Schneider等通過在人造血管內表面培養血管內皮細胞的方法構建具有完整內皮細胞層的小口徑人造血管，但是體外靜態培養的血管內皮細胞不能耐受體內水平的流動剪切力，在移植到體內I小時之內，15-85%的內皮細胞被血流沖走(Schneider, P., Hanson, S.&Price, T.1988.Durability ofconfluent endothelial cell monolayers on small calibre vascular prosthesesin vitro Surgery 103，456-462.)。Ott等通過對體外培養在血管支架上的內皮細胞施加流動剪切力，首先在l_2dyn/cm2的流動剪切力作用下誘導3天，再在25dyn/cm2的流動剪切力作用下誘導3天，最終發現剪切力誘導提高了血管內皮細胞的剪切力耐受會K 力(Ott, M.J., Olson, J.L.&Ballermann, B.J.1995.Chronic in vitro fow promotesultrastructural differentiat1n of endothelial cells.Endothelium 3，21-30)，但是Ott等施加在內皮細胞上的誘導剪切力變化過于劇烈，可能會損傷內皮細胞的正常功能。誘導剪切力變化過于劇烈是目前以剪切力誘導方式提高內皮細胞剪切力耐受能力的工作中存在的共性問題，因為血管內皮細胞對剪切力的變化非常敏感，Tsou等發現血管內皮細胞能夠感受到0.25dyn/cm2的剪切力變化，從而改變基因表達(Tsou，J.K.et al.2008.Spatial regulat1n of inflammat1n by human aortic endothelial cells in alinear gradient of shear stress.Microcirculat1n 15，311-323)，因此劇烈的剪切力變化可能會損傷血管內皮細胞的正常功能。綜上所述，采用逐漸地、緩慢地增加剪切力的方式誘導血管內皮細胞，提高血管內皮細胞抗流動剪切力的能力，是體外構建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內皮層的有效方法。
技術實現思路
根據本專利技術的一個方面，提供了一種簡單、快速、能夠體外構建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內皮層的方法。采用本專利技術所述的體外構建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內皮層的方法能夠對人造血管內腔表面的血管內皮細胞緩慢地，逐漸增加的施加流動剪切力，使內皮細胞處于不斷緩慢增加的流動剪切力環境中，從而給予血管內皮細胞充分的時間適應剪切力，誘導內皮細胞改變形態、細胞骨架和細胞外基質排列和其它功能，最終使內皮細胞耐受生理水平的流動剪切力，保持血管內皮層的完整，使血管內皮層具有抗血小板凝集的正常生理功能。采用本專利技術所述的體外構建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內皮層的方法，在人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力達到移植動脈部位的動脈血管內皮細胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平后，能夠對人造血管內腔表面的血管內皮細胞加載移植動脈部位的平均流動剪切力24-72小時，使血管內皮細胞有充分的時間適應生理水平的流動剪切力。采用本專利技術所述的體外構建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內皮層的方法，在人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力達到移植動脈部位的動脈血管內皮細胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平后，能夠對人造血管內腔表面的血管內皮細胞加載移植動脈部位的動脈脈搏波24-72小時，使血管內皮細胞有充分的時間適應生理水平的脈動剪切力。根據本專利技術的一個方面，體外構建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內皮層的方法，其特征在于:(I)在人造血管內腔表面接種血管內皮細胞；(2)將接種了血管內皮細胞的人造血管培養24-48小時，從而使血管內皮細胞長滿人造血管內腔表面；(3)將長滿血管內皮細胞的人造血管兩端連接到充滿了培養液的剪切力誘導系統的管路中，從而使人造血管和剪切力誘導系統的管路構成一個封閉的回路；(4)啟動剪切力誘導系統的液體驅動泵，設定初始流速，從而使流經人造血管內腔的培養液對血管內皮細胞的初始剪切力為0-2dyne/Cm2;(5)在剪切力施加一段時間后，調節液體驅動泵使培養液的流速比前一時間段流速提高一定比例，從而使人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例；所述的剪切力施加一段時間，是施加剪切力1-4小時；所述的調節液體驅動泵使培養液的流速比前一時間段流速提高一定比例，是培養液的流速比前一時間段流速提高5-20%之間的一個固定值；所述的使人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例，是流動剪切力比前一時間段流速提高5-20%之間的一個固定值；(6)此后每隔一段時間，調節液體驅動泵使培養液的流速比前一時間段流速提高一定比例，從而使人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例；直到人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力達到移植部位動脈血管內皮細胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平為止；所述的此后每隔一段時間，是每隔1-4小時；所述的調節液體驅動泵使培養液的流速比前一時間段流速提高一定比例，是培養液的流速比前一時間段流速提高5-20%之間的一個固定值；所述的使人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例，是流動剪切力比前一時間段流速提高5-20%之間的一個固定值；(7)保持人造血管內腔的血管內皮細胞受到的平均剪切力在移植部位動脈血管內皮細胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平，繼續培養24-72小時；(8)結束剪切力誘導，取下人造血管，用于后續生理指標檢測及血管移植。根據本專利技術的另一個方面，體外構建具有抗流動剪切力和抗血小板凝集功能的血管內皮層的方法，其特征在于:(I)在人造血管內腔表面接種血管內皮細胞；(2)將接種了血管內皮細胞的人造血管培養24-48小時，從而使內皮細胞長滿人造血管內腔表面；(3)將長滿內皮細胞的人造血管兩端連接到充滿了培養液的剪切力誘導系統的管路中，從而使人造血管和剪切力誘導系統的管路構成一個封閉的回路；(4)啟動剪切力誘導系統的液體驅動泵，設定初始流速，從而使流經人造血管內腔的培養液對血管內皮細胞的初始剪切力為0-2dyne/Cm2;(5)在剪切力施加I小時后，調節液體驅動泵使培養液的流速比前一小時流當前第1頁1 2本文檔來自技高網...
【技術保護點】
體外構建具有抗流動剪切和抗血小板凝集功能的血管內皮層的方法，其特征在于所述的方法包含以下步驟：(1)在人造血管內腔表面接種血管內皮細胞；(2)將接種了血管內皮細胞的人造血管培養24?48小時，從而使血管內皮細胞長滿人造血管內腔表面；(3)將長滿血管內皮細胞的人造血管兩端連接到充滿了培養液的剪切力誘導系統的管路中，從而使人造血管和剪切力誘導系統的管路構成一個封閉的回路；(4)啟動剪切力誘導系統的液體驅動泵，設定初始流速，從而使流經人造血管內腔的培養液對血管內皮細胞的初始剪切力為0?2dyne/cm2；(5)在剪切力施加一段時間后，調節液體驅動泵使培養液的流速比前一時間段流速提高一定比例，從而使人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例；所述的剪切力施加一段時間，是施加剪切力1?4小時；所述的調節液體驅動泵使培養液的流速比前一時間段流速提高一定比例，是培養液的流速比前一時間段流速提高5?20％之間的一個固定值；所述的使人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例，是流動剪切力比前一時間段流速提高5?20％之間的一個固定值；(6)此后每隔一段時間，調節液體驅動泵使培養液的流速比前一時間段流速提高一定比例，從而使人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例；直到人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力達到移植部位動脈血管內皮細胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平為止；所述的此后每隔一段時間，是每隔1?4小時；所述的調節液體驅動泵使培養液的流速比前一時間段流速提高一定比例，是培養液的流速比前一時間段流速提高5?20％之間的一個固定值；所述的使人造血管內腔的內皮細胞受到的剪切力比前一時間段提高一定比例，是流動剪切力比前一時間段流速提高5?20％之間的一個固定值；(7)保持人造血管內腔的血管內皮細胞受到的平均剪切力在移植部位動脈血管內皮細胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平，繼續培養24?72小時；(8)結束剪切力誘導，取下人造血管，用于后續生理指標檢測及血管移植。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：貢向輝，景曉輝，劉海峰，樊瑜波，何紅平，
申請(專利權)人：北京航空航天大學，
類型：發明
國別省市：北京;11
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