一種磷酸化肽的吸附富集方法、添加劑及其應(yīng)用技術(shù)

本申請(qǐng)公開(kāi)了一種磷酸化肽的吸附富集方法。本申請(qǐng)的吸附富集方法包括：(1)將非特異吸附抑制劑和部分待檢樣品添加到上樣緩沖液，采用富集過(guò)濾柱進(jìn)行磷酸化吸附富集；(2)收集富集產(chǎn)物，計(jì)算20種氨基酸在非磷酸化肽中豐度，作第一豐度，計(jì)算非磷酸肽所在蛋白質(zhì)中20種氨基酸的豐度，作第二豐度，第一豐度比第二豐度，選比值較高的至少一種氨基酸為添加劑；(3)采用加入添加劑的上樣緩沖液，對(duì)待檢樣品進(jìn)行磷酸化肽吸附富集。本申請(qǐng)，運(yùn)用氨基酸與多肽的競(jìng)爭(zhēng)吸附作用，減小非磷酸化肽的吸附，增加磷酸化多肽富集的吸附選擇性，為提高磷酸化檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性奠定基礎(chǔ)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種磷酸化肽的吸附富集方法、添加劑及其應(yīng)用
本申請(qǐng)涉及蛋白質(zhì)和多肽富集純化領(lǐng)域，特別是涉及磷酸化肽的吸附富集方法，用于磷酸化富集的添加劑，該添加劑的制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
在生物體細(xì)胞中，蛋白質(zhì)是主要的功能行使者，出于功能的需要，許多蛋白質(zhì)在翻譯中或翻譯后會(huì)在氨基酸鏈上共價(jià)結(jié)合各種非肽類(lèi)基團(tuán)，形成翻譯后修飾。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，可逆磷酸化控制著諸如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂、細(xì)胞間信息傳遞和基因表達(dá)等細(xì)胞活動(dòng)。但是，在蛋白質(zhì)樣品中，磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化肽的含量非常低，存在各種非磷酸化肽和無(wú)機(jī)鹽的干擾，使得磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化肽的檢測(cè)十分困難，因此，需要對(duì)樣品進(jìn)行磷酸化富集。二氧化鈦富集法作為目前使用最為廣泛的金屬氧化物富集磷酸肽的方法，在富集過(guò)程中對(duì)一些非磷酸化肽段存在一定的非特異性吸附作用。這些沒(méi)有磷酸化的肽段與磷酸化肽段一同被富集，降低了磷酸肽富集的選擇性。為了提高磷酸化肽富集選擇性，需要在上樣緩沖液中加入非特異抑制劑，以抑制非磷酸化的肽段被富集。目前，有多種非特異抑制劑被應(yīng)用，如2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)、鄰苯二甲酸(PA)、谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸。但是，現(xiàn)有的非特異抑制劑在磷酸化肽富集中的效果并不好，特別是在目前比較常用的二氧化鈦富集方法中，現(xiàn)有的非特異抑制劑的富集選擇性一般在60％-70％左右；也就是說(shuō)，仍然有30％-40％或更多的非磷酸化肽段被富集，這嚴(yán)重影響了磷酸化肽檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本申請(qǐng)的目的是提供一種新思路的磷酸化肽的富集方法，以及能夠增強(qiáng)磷酸化的特異性吸附的添加劑，和該添加劑的制備方法和應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用了以下技術(shù)方案：本申請(qǐng)公開(kāi)了一種磷酸化肽的吸附富集方法，包括：(1)將非特異吸附抑制劑添加到上樣緩沖液中，同時(shí)，將部分待檢樣品溶于上樣緩沖液中，采用富集過(guò)濾柱對(duì)磷酸化肽進(jìn)行吸附富集；(2)收集富集后的樣品，對(duì)其進(jìn)行分析，計(jì)算20種氨基酸在非磷酸化肽中豐度，作為第一豐度，并計(jì)算非磷酸肽所在蛋白質(zhì)中20種氨基酸的豐度作為第二豐度，計(jì)算所述第一豐度比第二豐度的比值，選擇比值較高的至少一種氨基酸作為添加劑；(3)將步驟(2)所述的添加劑加入到上樣緩沖液中，使用加入了添加劑的上樣緩沖液，再采用另外一個(gè)富集過(guò)濾柱對(duì)待檢樣品進(jìn)行磷酸化肽富集。其中，肽段是由蛋白質(zhì)酶解得到的，所以本申請(qǐng)中“非磷酸肽所在蛋白質(zhì)”是指經(jīng)過(guò)消化能得到此肽段的蛋白。需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)的關(guān)鍵在于，在本申請(qǐng)的磷酸化肽的吸附富集方法中，通過(guò)一種特殊的方式制取添加劑，并將該添加劑應(yīng)用于磷酸化肽的吸附富集；因此，采用富集過(guò)濾柱對(duì)磷酸化肽進(jìn)行吸附富集的具體操作包括參數(shù)設(shè)置、溶液配制、洗脫等，都可以參考常規(guī)的方式根據(jù)不同的檢測(cè)對(duì)象或過(guò)濾柱進(jìn)行調(diào)整，在本申請(qǐng)中不做具體限定。優(yōu)選的，富集過(guò)濾柱為固相金屬氧化物過(guò)濾柱；本申請(qǐng)中，金屬氧化物過(guò)濾柱選自二氧化鈦過(guò)濾柱、二氧化鋯過(guò)濾柱和二氧化硅過(guò)濾柱中的至少一種；優(yōu)選為二氧化鈦過(guò)濾柱。優(yōu)選的，非特異吸附抑制劑選自谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸中的至少一種。可以理解，在較次的方案中還可以采用其它具有類(lèi)似功能的化合物或組合物作為非特異吸附抑制劑，在本申請(qǐng)中不做具體限定。本申請(qǐng)的另一面公開(kāi)了一種磷酸化肽的金屬氧化物富集法，包括：(1)將非特異吸附抑制劑加入到上樣緩沖液中，同時(shí)，將部分待檢樣品溶于上樣緩沖液中，采用金屬氧化物過(guò)濾柱對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集；(2)收集富集后的樣品，對(duì)其進(jìn)行分析，計(jì)算20種氨基酸在非磷酸化肽中豐度，作為第一豐度，并計(jì)算非磷酸肽所在蛋白質(zhì)中20種氨基酸的豐度作為第二豐度，計(jì)算所述第一豐度比第二豐度的比值，選擇比值較高的至少一種氨基酸作為添加劑；(3)將步驟(2)所述的添加劑加入到上樣緩沖液中，使用加入添加劑的上樣緩沖液，采用另外一個(gè)金屬氧化物過(guò)濾柱對(duì)待檢樣品進(jìn)行磷酸化肽富集。需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)的關(guān)鍵在于，在本申請(qǐng)的磷酸化肽的金屬氧化物富集法中，通過(guò)一種特殊的方式制取添加劑，并將該添加劑應(yīng)用于磷酸化肽的吸附富集；因此，采用金屬氧化物過(guò)濾柱對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集的具體操作包括參數(shù)設(shè)置、溶液配制、洗脫等，都可以參考常規(guī)的方式根據(jù)不同的檢測(cè)對(duì)象或過(guò)濾柱進(jìn)行調(diào)整，在本申請(qǐng)中不做具體限定。優(yōu)選的，金屬氧化物過(guò)濾柱選自二氧化鈦過(guò)濾柱、二氧化鋯過(guò)濾柱和二氧化硅過(guò)濾柱中的至少一種；優(yōu)選為二氧化鈦過(guò)濾柱。本申請(qǐng)的再一面公開(kāi)了一種磷酸化肽的二氧化鈦富集法，包括：(1)將非特異吸附抑制劑加入到上樣緩沖液中，同時(shí)，將部分待檢樣品溶于上樣緩沖液中，采用二氧化鈦過(guò)濾柱對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集；(2)收集富集后的樣品，對(duì)其進(jìn)行分析，計(jì)算20種氨基酸在非磷酸化肽中豐度，作為第一豐度，并計(jì)算非磷酸肽所在蛋白質(zhì)中20種氨基酸的豐度作為第二豐度，計(jì)算所述第一豐度比第二豐度的比值，選擇比值較高的至少一種氨基酸作為添加劑；(3)將步驟(2)所述的添加劑加入到上樣緩沖液中，使用加入添加劑的上樣緩沖液，再采用另外一個(gè)二氧化鈦過(guò)濾柱對(duì)待檢樣品進(jìn)行磷酸化肽富集。需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)的關(guān)鍵在于，在本申請(qǐng)的磷酸化肽的二氧化鈦富集法中，通過(guò)一種特殊的方式制取添加劑，并將該添加劑應(yīng)用于磷酸化肽的吸附富集；因此，采用二氧化鈦過(guò)濾柱對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集的具體操作包括參數(shù)設(shè)置、溶液配制、洗脫等，都可以參考常規(guī)的方式根據(jù)不同的檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行調(diào)整，在本申請(qǐng)中不做具體限定。本申請(qǐng)的再一面公開(kāi)了一種用于金屬氧化物富集法的添加劑的制備方法，包括以下步驟，(1)將非特異吸附抑制劑添加到上樣緩沖液中，同時(shí)，將部分待檢樣品溶于上樣緩沖液中，采用金屬氧化物過(guò)濾柱對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集；(2)收集富集后的樣品，對(duì)其進(jìn)行分析，計(jì)算20種氨基酸在非磷酸化肽中豐度，作為第一豐度，并計(jì)算非磷酸肽所在蛋白質(zhì)中20種氨基酸的豐度作為第二豐度；(3)計(jì)算所述第一豐度比第二豐度的比值，選擇比值較高的至少一種氨基酸作為添加劑。優(yōu)選的，本申請(qǐng)的添加劑的制備方法中，金屬氧化物富集法為二氧化鈦富集法，金屬氧化物過(guò)濾柱為二氧化鈦過(guò)濾柱。在本申請(qǐng)?zhí)砑觿┑闹苽浞椒ǖ幕A(chǔ)上，本申請(qǐng)還公開(kāi)了一種由本申請(qǐng)的制備方法制備的添加劑。在本申請(qǐng)的添加劑的基礎(chǔ)上，本申請(qǐng)還公開(kāi)了一種添加有本申請(qǐng)的添加劑的上樣緩沖液。本申請(qǐng)中，待檢樣品是指從動(dòng)物、植物或其它生物樣本中提取的蛋白質(zhì)樣品，通常呈凍干的固體或高濃度的液體。通常，進(jìn)行磷酸化檢測(cè)時(shí)，首先將該蛋白質(zhì)樣品溶于上樣緩沖液中，然后采用金屬氧化物富集法富集磷酸化肽，最后對(duì)富集處理后的樣品進(jìn)行磷酸化檢測(cè)。需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)中所有的非特異吸附抑制劑都可以采用常規(guī)的磷酸化吸附中所使用的非特異吸附抑制劑，本申請(qǐng)不做具體限定；但是，考慮到抑制效果，本申請(qǐng)優(yōu)選的方案中，非特異吸附抑制劑都選自谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸中的至少一種。由于采用以上技術(shù)方案，本申請(qǐng)的有益效果在于：本申請(qǐng)的磷酸化肽的吸附富集方法，靈活運(yùn)用氨基酸與多肽的競(jìng)爭(zhēng)吸附作用，在對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集時(shí)，將非特異吸附的多肽中豐度較高的氨基酸作為添加劑加入到上樣緩沖液中，由于競(jìng)爭(zhēng)吸附，相對(duì)于肽段，分子量較小的氨基酸比較容易被吸附，從而減小了非磷酸化的肽段的吸附，增加了磷酸化肽富集方法的吸附選擇性，為提高磷酸化檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1：是本申本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種磷酸化肽的吸附富集方法，包括：(1)將非特異吸附抑制劑添加到上樣緩沖液中，同時(shí)，將部分待檢樣品溶于上樣緩沖液中，采用富集過(guò)濾柱對(duì)磷酸化肽進(jìn)行吸附富集；(2)收集富集后的樣品，對(duì)其進(jìn)行分析，計(jì)算20種氨基酸在非磷酸化肽中豐度，作為第一豐度，并計(jì)算非磷酸肽所在蛋白質(zhì)中20種氨基酸的豐度作為第二豐度，計(jì)算所述第一豐度比第二豐度的比值，選擇比值較高的至少一種氨基酸作為添加劑；(3)將步驟(2)所述的添加劑加入到上樣緩沖液中，使用加入了添加劑的上樣緩沖液，再采用另外一個(gè)富集過(guò)濾柱對(duì)待檢樣品進(jìn)行磷酸化肽富集。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種磷酸化肽的吸附富集方法，包括：(1)將非特異吸附抑制劑添加到上樣緩沖液中，同時(shí)，將部分待檢樣品溶于上樣緩沖液中，采用富集過(guò)濾柱對(duì)磷酸化肽進(jìn)行吸附富集；(2)收集富集后的樣品，對(duì)其進(jìn)行分析，計(jì)算20種氨基酸在非磷酸化肽中豐度，作為第一豐度，并計(jì)算非磷酸肽所在蛋白質(zhì)中20種氨基酸的豐度作為第二豐度，計(jì)算所述第一豐度比第二豐度的比值，選擇比值較高的至少一種氨基酸作為添加劑；(3)將步驟(2)所述的添加劑加入到上樣緩沖液中，使用加入了添加劑的上樣緩沖液，再采用另外一個(gè)富集過(guò)濾柱對(duì)待檢樣品進(jìn)行磷酸化肽富集。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附富集方法，其特征在于：所述富集過(guò)濾柱為固相金屬氧化物過(guò)濾柱；所述金屬氧化物過(guò)濾柱選自二氧化鈦過(guò)濾柱、二氧化鋯過(guò)濾柱中的至少一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附富集方法，其特征在于：所述金屬氧化物過(guò)濾柱為二氧化鈦過(guò)濾柱。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附富集方法，其特征在于：所述非特異吸附抑制劑選自谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸中的至少一種。5.一種磷酸化肽的金屬氧化物富集法，包括：(1)將非特異性吸附抑制劑加入到上樣緩沖液中，同時(shí)，將部分待檢樣品溶于上樣緩沖液中，采用金屬氧化物過(guò)濾柱對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集；(2)收集富集后的樣品，對(duì)其進(jìn)行分析，計(jì)算20種氨基酸在非磷酸化肽中豐度，作為第一豐度，并計(jì)算非磷酸肽所在蛋白質(zhì)中20種氨基酸的豐度作為第二豐度，計(jì)算所述第一豐度比第二豐度的比值，選擇比值較高的至少一種氨基酸作為添加劑；(3)將步驟(2)所述的添加劑加入到上樣緩沖液中，使用加入添加劑的上樣緩沖液，采...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：訾金，張朝良，林梁，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：深圳華大基因研究院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東;44