從乳中提取蛋白質的方法技術

本發明專利技術公開了一種從乳中提取蛋白質的方法，具有至少一個疏水腔和在乳固有pH值下的負電荷，該方法包括以下步驟：a）乳的撇取和脫脂；b）在能使蛋白保留在基體上的pH條件下，將包含該蛋白質的所脫脂并撇取的餾分通過層析基體，其上嫁接有既具有疏水特性又具有離子特性的配體，該pH值高于4.6；c）蛋白質的洗脫；d）通過從餾分中去除乳蛋白質進行餾分的凈化；以及e）回收該蛋白質。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了一種，具有至少一個疏水腔和在乳固有pH值下的負電荷，該方法包括以下步驟：a）乳的撇取和脫脂；b）在能使蛋白保留在基體上的pH條件下，將包含該蛋白質的所脫脂并撇取的餾分通過層析基體，其上嫁接有既具有疏水特性又具有離子特性的配體，該pH值高于4.6；c）蛋白質的洗脫；d）通過從餾分中去除乳蛋白質進行餾分的凈化；以及e）回收該蛋白質。【專利說明】
本專利技術涉及一種或多種蛋白質，尤其是其三級結構形成疏水區并且存在于乳中的球狀蛋白質的提取過程，該提取過程使用一種載體，該載體與同時具有疏水性和離子性的配體結合。
技術介紹
市場上買得到的多數藥物由通過合成而獲得的化學物質組成。事實上，直到目前，現代醫學已嚴重依賴于通過化學合成而生產的藥物來進行治療和疾病診斷。然而，蛋白質表現了攜帶生物信息的分子的有效部分。尤其對于大量激素、生長因子、血液凝固因子、和甚至抗體來說，情況就是這樣。一般來說，蛋白質為由氨基酸組成的聚合物，通常具有高分子量、并且不能通過合理成本下的化學合成方式獲得。治療使用的蛋白質通常是從，例如活體、組織或者人類或動物的血液等中分離和純化得到的。對于從豬胰腺中提取的胰島素、例如因子VIII或因子IX等從血漿中提取的凝固因子、以及免疫球蛋白來說情況就是這樣。然而，盡管前述蛋白質的制備過程今天被廣泛使用，但是它們具有缺點。從血小板中提取的某種蛋白質的低含量使滿足日益增長的治療需求的足夠量的離析無法進行。而且，血漿中病毒、朊病毒、或其它病原體的存在使得對于血漿蛋白的制造過程來說包括附加的病毒中和和/或病毒消去步驟是必需的，以獲得可以用于治療目的的該產品。為了彌補這些缺點，已經求助于基因工程，該技術也同樣廣泛用于將孤立基因轉移至細胞的蛋白質合成，隨后進行正被討論的蛋白質的分泌過程。從其自有原始細胞系統外部獲得的這種蛋白質為公知的“重組”蛋白質。根據該技術，可以使用各種細胞系統。例如E.coli等細菌系統被非常廣泛地使用并且非常有效。它們使以低成本生產重組蛋白質成為可能。然而，該系統只限于用于不需要精細折疊過程的簡單、非糖基化蛋白質的制備。真菌系統也用于分泌蛋白質的制備。該真菌系統的缺點在于以下事實，即它們引起翻譯后修飾，包括，例如多糖單元和硫酸基團的接枝，這極大影響了合成蛋白質的藥物特性，尤其是通過加成各種甘露糖衍生物基團。使用桿狀病毒的系統使生產例如疫苗蛋白質或生長激素等多種蛋白質成為可能；然而，它們的工業應用并不樂觀。哺乳動物細胞也在例如單克隆抗體等復雜重組蛋白質的制備中生長。細胞表達系統導致適當地折疊和修飾重組蛋白質。關于產品成本的低收率是主要缺點。作為對該細胞系統的替代，轉基因植物被采用，以獲得有效數量的蛋白質。然而，這些系統引起植物特異性翻譯后修飾，尤其是通過將高免疫木糖殘基加成到合成蛋白質上，因而限定了它們用于治療目的的使用。 對以上所提及細胞系統的一個替代包括使用轉基因動物，用于重組疫苗或復雜治療蛋白質的生產。所合成蛋白質展示了非常類似于人類蛋白質的糖基化，并且被適當地折疊。這些復雜蛋白質不僅僅包括例如生長激素等單獨的多肽鏈；相反，它們在氨基酸組合之后以各種方式修飾，尤其是通過特異性斷裂、糖基化和羧甲基化。在絕大多數情況下，該修飾不能通過細菌細胞或酵母來執行。相反地，轉基因動物使得在細菌細胞系統中所發現的表達水平和使用細胞培養所獲得的翻譯后修飾這兩者的結合成為可能，其所有產品成本低于通過使用細胞表達系統而擔負的成本。在轉基因動物的生物材料中，乳已成為已導致其被考慮作為重組蛋白質的非常良好的分泌源的研究主體。從轉基因動物的乳中所生產的重組蛋白可以輕易的通過將編碼有期望得到的蛋白質的基因嫁接到乳中的蛋白質合成基因之一的調控區而獲得，這將該蛋白質特定地導向乳腺，并隨后在乳中分泌。作為一個實例，可以參考歐洲專利申請號EP0527063，其描述了轉基因哺乳動物的乳中的期望蛋白質的生產，其中編碼期望蛋白質的基因表達由乳清蛋白啟動子控制。其它專利或專利申請描述了轉基因哺乳動物的乳中的抗體的制備(EP0741515)、膠原(W096/03051)、人類因子IX (US6046380)、以及因子VIII/血管性血友病因子絡合物(EP0807170)。盡管在蛋白質表達方面這些方法結果令人滿意，但是使用乳作為重組蛋白源具有缺點。主要缺點在于一方面是難以具有令人滿意收率地從乳中提取它們、另一方面是隨后的純化的困難。事實上，乳是一種包括90%水以及可以劃分入三類中的各種其它組分的混合物。第一類，被稱作“抗乳血清”(或乳清)，包括碳水化合物、可溶性蛋白質、無機物和水溶性維生素。第二類，被稱作“脂相”(或乳脂)，包含乳化形式的脂肪材料。第三類，被稱作“蛋白質相”，包括大約80 %酪蛋白，形成一組蛋白，其在鈣存在的情況下，可以在pH值為4.6時或通過凝乳酶的作用而沉淀。各種酪蛋白可以與磷鈣鹽形成達到跟0.5 μ m類似直徑的膠體膠束絡合物，例如磷酸三鈣聚合體(“族”)，即Ca9(P04)6。該膠束由酪蛋白亞基組成，該酪蛋白亞基由富含有k-酪蛋白的親水層圍繞疏水核組成，磷鈣鹽通過靜電相互作用而與親水層結合。這些磷鈣鹽也可以存在于膠束體內部，不與酪蛋白結合。該蛋白質相也包含可溶性蛋白質，例如乳清蛋白和乳球蛋白，以及來自血液的清蛋白和免疫球蛋白。依賴于轉基因動物乳中所分泌的重組蛋白質的種類，該蛋白質可以或者存在于抗乳血清中或者存在于蛋白質相中，或者甚至同時存在于它們兩者中。乳組分中每一種類的富足和復雜使得進行蛋白質的提取更加困難，尤其是在酪蛋白膠束中的一種。另一個困難在于以下事實，即在兩個相中任意一個中的該蛋白質的優勢不能被確定性地預測。重組蛋白質也可以展示乳中鈣離子的親和力，其以鹽和/或各種可溶性復合物的形態、或以酪蛋白膠束鈣磷酸鹽的形態存在。這些親和力通過蛋白質和二價鈣陽離子之間的靜電鍵來反映。蛋白質/鈣離子親和力使得定義親和常數成為可能，其依賴于它們的值，并確定了鍵的強度。一般來說，大部分具有鈣離子親和力的蛋白質與膠束的鈣磷酸鹽結合。它們的提取需要執行復雜步驟，具有相應的執行和收率的問題。乳業中所使用的傳統解決方法是隔離蛋白質，其包括巴氏滅菌法，隨后是酶凝聚或酸沉降(在PH值為4.6處)，這在該情況下并不能應用，因為重組蛋白質通常由于溫度和pH值的組合影響而變性。而且，蛋白質圈閉入酪蛋白膠束中導致低提取收率。其它解決方法，包括使用過濾、離心分離、和/或沉淀或沉降技術來執行分餾乳的物理方法，也導致不可接受的提取收率以及所提取重組蛋白質的純度低。文檔EP0264166描述了在轉基因動物的乳中的期望蛋白質的分泌。該文檔沒有提及用于從乳中純化該蛋白質的任何步驟。美國專利號4519945描述了通過從乳中制備酪蛋白和抗乳血清的沉淀來提取重組蛋白質的過程，其進行具有如上所述的酸化和加熱步驟。該過程導致所討論的蛋白質活性的顯著損失以及低提取收率。美國專利號6984772批露了從轉基因哺乳動物乳中純化重組纖維蛋白原的過程。該過程包括有使用連續離心操作從酪蛋白顆粒和蛋白質相中分離抗乳血清的步驟。抗乳血清被分離并且隨后被存儲用于該過程的其他步驟，其給出了純化纖維蛋白原的解決方法。然而，該過程不能以令人滿意本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于乳中所存在蛋白質的提取方法，該蛋白質在乳的正常pH值下具有至少一個疏水區以及負電荷，包括以下步驟：a）撇取和脫脂該乳，b）在允許所述蛋白質在層析載體上被捕獲的pH值下，將包含所述蛋白質的脫脂和撇取后的餾分轉移到層析載體上，在該層析載體上，嫁接有同時為疏水的和離子的配體，所述pH值高于4.6，c）洗脫該蛋白質，d）通過從所洗脫餾分中去除乳蛋白質來純化該所洗脫餾分，以及e）回收所述蛋白質。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：米歇爾·諾格雷，拉蘭·勒雅爾，莫妮克·奧利維耶，
申請(專利權)人：LFB生物技術公司，
類型：發明
國別省市：法國;FR