本發明專利技術將一種部分脫乙酰化的幾丁質衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域(Chitin?Binding?Domain，CBD)的融合蛋白。其原理是通過NaOH堿液加熱處理，使幾丁質發生脫乙酰作用，此后再通過乙酸處理使其乙?；?，從而得到部分脫乙酰化的幾丁質衍生物，將這種部分脫乙酰化的幾丁質衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域的融合蛋白，可以很好地改善其對含有幾丁質結合域(Chitin?Binding?Domain，CBD)的融合蛋白的特異性吸附效果。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程產品下游分離純化領域，涉及將部分脫乙酰的幾丁質衍生物應用于特異性吸附分離純化含幾丁質結合結構域(Chitin Binding Domain,CBD)的融合蛋白。
技術介紹
當采用基因工程技術表達一些外源性多肽或小分子蛋白時，表達產物往往會由于被宿主細胞內的蛋白酶降解而造成表達量大大降低。為了有效解決這一問題，目前普遍采用融合表達技術。所謂融合表達就是通過基因重組技術將外源小分子蛋白(多肽)拼接于融合伴侶(標簽)下游進行表達，然后通過酶切或化學切割釋放出目的小分子蛋白(多肽)的技術。在進行基因拼接融合時應保持目的小分子蛋白(多肽)編碼基因與融合伴侶(標簽)編碼基因閱讀框架一致。此外，在融合伴侶與目的蛋白(多肽)之間需要設計I個或I個以上的蛋白酶切位點(如腸激酶切割位點)或化學切割位點或可以自己切割的蛋白內含子(intein)，這樣就可以在融合蛋白表達出來之后通過酶切或化學切割或誘導自切割等手段釋放出目的小分子蛋白(多肽)。采用融合伴侶(標簽)進行融合表達的優點在于:⑴對分子量較小的外源目的小分子蛋白(多肽)進行融合表達可增強表達產物的穩定性，減少或避免宿主細胞蛋白酶對表達產物的降解；(2)某些融合伴侶(標簽)可以增強目的蛋白或多肽的可溶性；(3)方便目的蛋白的分離純化。目前普遍使用在低等生物或細菌中，以可溶性狀態高表達的蛋白作為融合伴侶(標簽)以提高目的小分子蛋白(多肽)的表達量、可溶性及穩定性，采用的融合伴侶(標簽)有曼氏血吸蟲谷胱甘肽-S-轉移酶(GST，28kDa)、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白(MBP，40kDa)、蛋白二硫化物異構酶(NusA, 55kDa)、大腸桿菌二硫鍵異構酶(Dsb A,21kDa)等。除了上述融合伴侶以外，環狀芽孢桿菌幾丁質結合結構域(Chitin BindingDomain, CBD, 5kDa)也是一種較為理想的分子融合伴侶，與之進行融合表達的產物便可以通過與幾丁質的特異性吸附進行分離純化。然而，天然幾丁質是一種由N-乙酰氨基葡萄糖以β_1，4糖苷鍵組成的直鏈多聚體，性質比較穩定，不溶于水、稀堿、稀酸以及大部分有機溶劑，直接應用于含幾丁質結合域融合蛋白的分離純化其吸附效果往往不夠理想。由于天然幾丁質結構中含有大量的-OH和-ΝΗ2基團，可以對其進行化學修飾制備各種衍生物，以改善其理化性質。為此，本專利技術通過將幾丁質進行脫乙酰化作用以及乙?；饔脤ζ浠罨螅瑢⒅畱糜诤瑤锥≠|結合結構域的融合蛋白的吸附分離純化，大大改善了其對含有幾丁質結合結構域的融合蛋白的吸附效果。
技術實現思路
本專利技術將一種部分脫乙酰化的幾丁質衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域(Chitin Binding Domain, CBD)的融合蛋白。其原理是通過NaOH堿液加熱處理,使幾丁質發生脫乙酰作用，此后再通過乙酸處理使其乙酰化，從而得到部分脫乙酰化的幾丁質衍生物，將這種部分脫乙?；膸锥≠|衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域的融合蛋白，可以很好地改善了其對含有幾丁質結合結構域(Chitin Binding Domain, CBD)的融合蛋白的特異性吸附效果。【附圖說明】圖1、本專利技術構建的pTWINl-lun融合表達質粒圖譜。CBD:幾丁質結合結構域(Chitin Binding Domain, CBD)基因；intein splicing site 為 Ssp DnaB 蛋白內含子自切割位點；LUN為Iunasin編碼基因圖2、CBD_Ssp DnaB intein-lunasin融合蛋白的基因編碼序列。CBD:幾丁質結合結構域基因序列；Ssp DnaB intein:可自切割的蛋白內含子基因序列；lunasin:lunasin編碼基因圖 3、融合蛋白 CBD-Ssp DnaB intein-lunasin 在培養基中表達的 15% SDS-PAGE電泳圖。泳道M:分子量標準蛋白質(kDa)，分子量分別為116.0, 66.2，45.0, 35.0, 25.0, 18.4，14.4(自上而下)；泳道1:未經乳糖誘導的發酵液菌體破菌上清；泳道2:經0.2% (w /V)乳糖誘導表達的發酵液菌體破菌上清圖 4、融合蛋白 CBD-Ssp DnaB intein-lunasin 的 Western Blot 鑒定分析圖譜。一抗為兔抗Iunasin抗體，二抗為羊抗兔抗體。泳道1:大腸桿菌宿主菌E.coli BL21(DE3)發酵液菌體破菌上清(對照組);泳道2:工程菌pTWINl-lun / E.coli BL21(DE3)經0.2%(w / v)乳糖誘導表達的發酵液菌體破菌上清圖5、本專利技術制備的部分脫乙?；膸锥≠|衍生物層析柱純化產物的Tricine / SDS-PAGE電泳圖。泳道M:分子量標準蛋白質(kDa)，分子量分別為100，30，25，20，15，10, 5,3.4(自上而下)；泳道1_4:部分脫乙酰化的幾丁質衍生物層析柱純化產物圖6、本專利技術制備的部分脫乙?；膸锥≠|衍生物柱層析及RP-HPLC純化后的Iunasin質譜鑒定圖【具體實施方式】實施例1部分脫乙?；膸锥≠|衍生物柱材的制備取30g幾丁質(阿拉丁試劑(上海)有限公司)于1000mL燒杯中，加200mL雙蒸水浸泡過夜；傾倒掉雙蒸水，加入500mL2mol / L HCl浸泡2h，抽濾，之后水洗至中性；再加500mL I mol / L NaOH浸泡，并將燒杯至于100°C水浴鍋中水煮lh，抽濾，再水洗至中性；再加500mL0.01mol / LNaOH浸泡，將燒杯至于50°C水浴鍋中水煮lh，抽濾，水洗至中性；再加500mL0.01mol / LCH3COOH,將燒杯至于50°C水浴鍋中水煮0.5h，抽濾，水洗至中性。最后將經過處理的幾丁質置于真空干燥器中進行真空干燥處理，真空干燥器溫度不宜超過80°C，完全干燥之后將幾丁質置于研缽中進行研磨，常溫真空干燥保存，備用。實施例2含幾丁質結合結構域(Chitin Binding Domain, CBD)的融合蛋白的設計與克隆根據Iunasin 多肽的氨基酸序列，采用 OPTIMIZER (http: / / genomes.urv.es/OPTIMIZER)和 Gene Designer (http: / / www.DNA20.com)軟件以及大腸桿菌偏愛的密碼子設計了 Iunasin多肽的基因編碼序列，并在其兩側添加了 Sap I和Pst I酶切位點。通過重疊延伸PCR方法得到了兩側含Sap I和Pst I酶切位點的Iunasin多肽編碼基因序列，并 TA-克隆到 pMD?19-T Simple Vector (TaKaRa Biotech (大連)公司產品)中，Sap I 和Pst I雙酶切后，再亞克隆到pTWINl載體(New England Biolabs公司產品)中，得到重組質粒pTWINl-lun (圖1),其中融合表達基因依次包括幾丁質結合結構域(Chitin BindingDomain, CBD)基因、Ssp DnaB蛋白內含子基因以及Iunasin編碼基因(圖2)。該融合表達質粒轉化大腸桿菌宿主E.coli BL21(DE3)菌感本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種將部分脫乙?；膸锥≠|衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域(Chitin?Binding?Domain，CBD)的融合蛋白的方法。
【技術特征摘要】
1.一種將部分脫乙?；膸锥≠|衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域(...
【專利技術屬性】
技術研發人員：譚樹華，張怡，
申請(專利權)人：中國藥科大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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