一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)制備半抗原，將半抗原通過戊二醛法偶聯(lián)蛋白，得到鄰苯二甲酸二丁酯完全抗原，與弗氏佐劑混合均勻后，通過皮下注射免疫BALB/c小鼠；用重氮化法合成包被抗原用于小鼠血清和細(xì)胞上清的篩選。將免疫小鼠的脾細(xì)胞通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過間接ELISA和間接競爭ELISA篩選和三次亞克隆，得到一株群選性的雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株C。本發(fā)明專利技術(shù)提供的單克隆細(xì)胞株C對DEHP、DINP也具有一定的識別能力，可以滿足目前市場上對鄰苯二甲酸酯類塑化劑免疫檢測產(chǎn)品的需求。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
[0001 ] 本專利技術(shù)涉及一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，涉及鄰苯二甲酸酯類塑化劑通用單克隆抗體的制備方法，屬于食品安全免疫學(xué)檢測
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技術(shù)介紹
塑化劑(Plasticizer),是一種增加材料的柔軟性或是材料液化的添加劑。其中最常見的塑化劑是鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)(Phthalate Esters, PAEs),是鄰苯二甲酸的酯化衍生物。鄰苯二甲酸酯類塑化劑是具些許芳香氣味或無氣味的無色液體，中等黏度、高穩(wěn)定性、低揮發(fā)性、成本低廉、低水溶解度，但易溶于多數(shù)有機(jī)溶劑中。鄰苯二甲酸酯類在日常及工業(yè)上被廣泛使用，以鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)為最大宗，占塑化劑產(chǎn)量的四分之三，其次是鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)。鄰苯二甲酸酯類塑化劑被歸類為疑似環(huán)境荷爾蒙，其生物毒性主要屬雌激素與抗雄激素活性，會造成內(nèi)分泌失調(diào)，阻害生物體生殖機(jī)能，包括生殖率降低、流產(chǎn)、天生缺陷、異常的精子數(shù)、睪丸損害，還會引發(fā)惡性腫瘤、造成畸形兒。近年來，酒、飲料、食用油以及方便食品中鄰苯二甲酸酯類塑化劑超標(biāo)事件頻發(fā)，人們談“塑”色變，使得鄰 苯二甲酸酯的快速、準(zhǔn)確檢測成為迫切需求。目前檢測PAEs的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS)等儀器檢測方法，而免疫分析方法相對較少。其中儀器檢測方法檢測準(zhǔn)確，但儀器昂貴，操作復(fù)雜，樣品前處理繁瑣。免疫分析方法相對于儀器檢測方法，具有低成本、高通量、高靈敏、對技術(shù)人員要求低等特點，因此適用于大量樣品的快速篩查?！緦＠夹g(shù)內(nèi)容】本專利技術(shù)的目的在于提供一種鄰苯二甲酸酯類塑化劑通用性單克隆抗體的制備方法，通過細(xì)胞株的篩選，得到的抗體對鄰苯二甲酸酯類DBP、DIBP、BBP、DNP等具有較好檢測靈敏度，可以用來建立鄰苯二甲酸酯類總量的免疫學(xué)檢測方法。本專利技術(shù)的技術(shù)方案:一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其分類命名為單克隆細(xì)胞株C號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9303。菌株單克隆細(xì)胞株C號分泌產(chǎn)生的鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體，其由鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株C號所分泌產(chǎn)生。所述鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體應(yīng)用于鄰苯二甲酸酯類的多殘免疫檢測。提供的鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體的制備方法基本步驟為: (O半抗原的制備:a、酯化反應(yīng):稱取0.12mol的4-硝基鄰苯二甲酸于IOOmL三頸燒瓶，加入0.1mol正丁醇，加入6mL苯助溶，磁力攪拌，緩慢加入1.6mL濃硫酸，加熱升溫至120°C，反應(yīng)12h，減壓蒸去有機(jī)溶劑，將油狀殘留加入到冷水中并用10%的Na2CO3溶液洗至下層水層無色，上層得到暗紅色的油狀粗品，用無水乙醇重結(jié)晶得到4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯。b、還原反應(yīng):稱取7mmol的還原鐵粉于50mL圓底燒瓶,加入2mL水、Immol氯化銨，水浴加熱15min。另取4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯1.4mmol,用5mL甲醇溶解,分3次加入上述反應(yīng)液中，回流反應(yīng)5h。趁熱過濾鐵粉，將濾液減壓蒸餾，得到的橙紅色殘留用少量熱甲醇溶解，低溫析出1.17mmol 4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯作為半抗原備用。(2)完全抗原的制備:采用戊二醛法合成免疫原，重氮化法合成包被原。免疫原合成的具體步驟如下:將5mg半抗原用DMF溶解，與戊二醛溶液以1:1.2的摩爾比混合，室溫下活化30min后,將活化液逐滴加入IOmg KLH中，室溫反應(yīng)3_4h,用0.1mol PBS透析5天即可； 包被原合成的具體步驟如下:A液制備:取0.023mmol半抗原于25mL燒杯中，加入2mLDMF,0.2mL水和0.2mL的lmol/L鹽酸，形成黃色溶液，冷至0_5°C。然后逐滴滴加lmol/L亞硝酸鈉溶液，用淀粉碘化鉀試紙監(jiān)測，直到試紙變藍(lán)灰色停止滴加，4°C下攪拌lh。B液制備:稱取150mg的OVA溶于6mL pH 9.0硼酸鹽緩沖液，4°C保存。在4°C攪拌下，將A液逐滴滴加到B液中，并用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使pH保持在9，4°C攪拌過夜，透析即得到包被原(DBP-OVA)。(3)動物免疫與效價測定:采用小劑量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠，首次免疫用IOOyg偶聯(lián)抗原 與等量福氏完全佐劑混勻后進(jìn)行皮下注射，間隔3周后，再用IOOyg偶聯(lián)抗原與等量福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，此后每隔3周用半量偶聯(lián)抗原加強(qiáng)免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后采用腹腔免疫，通過間接競爭ELISA檢測血清效價和抑制； 其具體ELISA程序如下: 1)包被:將包被抗原用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，100 μ L/孔，37 °C孵育2h ； 2)洗滌:將板內(nèi)溶液傾去,每孔注入200μ L PBST溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗滌3次。以下洗滌方法相同； 3)封閉:拍干后，加入200yL/孔封閉液，37°C孵育2h。洗滌后烘干備用； 4)加樣:酶標(biāo)板上半部分加入PBS，50μ L/孔(上半部分稱為O標(biāo))，下半部分加入不同濃度的鄰苯二甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品，將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，50 μ L/孔(下半部分成為加標(biāo))，上下部分對應(yīng)加入不同稀釋梯度包被抗原的孔中，37°C孵育30min ;充分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，100 μ L/孔，37°C孵育30min，洗滌后拍干； 5)顯色:將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μ L的顯色液(TMB與底物液比例1:5)，37°C避光反應(yīng) 15min ； 6)終止和測定:取出酶標(biāo)板,每孔加入50μ L終止液(2mol/L的硫酸)終止反應(yīng),然后用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光值A(chǔ)45tl ； 7)結(jié)果判讀:以O(shè)D值大于或等于陰性血清對照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所對應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價。上下部分對照，加標(biāo)OD值為O標(biāo)一半的，即是所加的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。(4)細(xì)胞融合與篩選:在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為1450)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下: a、無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)； b、收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)； C、將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照數(shù)量比1: 10的比例混合，離心后用50% PEG融合，時間I min，之后按照從慢到快，加入RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50XHAT的RPM1-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合的第三天對融合細(xì)胞進(jìn)行RPM1-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天進(jìn)行用含20%胎牛血清、 1%的100 XHT的RPM1-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第9天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選分三步:第一步先用間接ELISA篩選出陽性細(xì)胞孔。第二步選用DBP、BBP、DIBP及DNP為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競爭ELISA對陽性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測定。第三步將第二步篩選出的孔進(jìn)行擴(kuò)大本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其分類命名為單克隆細(xì)胞株C號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.9303。
【技術(shù)特征摘要】
1.一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其分類命名為單克隆細(xì)胞株C號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.9303。2.權(quán)利要求1所述菌株單克隆細(xì)胞株C號分泌產(chǎn)生的鄰苯二甲酸酯類通用性...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：匡華，胥傳來，郭玲玲，徐麗廣，馬偉，劉麗強(qiáng)，宋珊珊，吳曉玲，
申請(專利權(quán))人：無錫杰圣杰康生物科技有限公司，江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32
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