本發明專利技術公開了一種能夠提高番茄果實營養品質的獼猴桃基因及其應用方法，特征是該獼猴桃基因具有序列表SEQ?ID?NO.1的DNA序列；將其克隆至真核表達載體，獲得含有獼猴桃基因序列SEQ?ID?NO.1的質粒；將該質粒轉化農桿菌，將轉化的農桿菌用于侵染番茄愈傷組織，獲得能夠提高番茄果實中糖分、色素含量的轉基因植株。采用本發明專利技術的轉基因番茄果實與野生型番茄果實相比，番茄果實的糖分，番茄紅素，beta-胡蘿卜素，葉綠素的含量能夠得到明顯提高。本發明專利技術所獲得的基因SEQ?ID?NO.1在研究調控果實色素的積累過程和改良果實營養品質方面具有著重要理論意義和實際立用價值。
【技術實現步驟摘要】
一種能夠提高番茄果實營養品質的獼猴桃基因及其應用
本專利技術屬于植物基因工程
，具體涉及與獼猴桃果實營養品質有關的基因序列，含該基因的真核表達重組質粒及所構建的真核表達載體在番茄果實營養品質改良中的應用方法。
技術介紹
果實中的色素含量是影響外部觀感的重要因素，糖分、類胡蘿卜素、維生素、礦物質含量等決定了果實的營養價值。目前，常采用三種方式來提高果實中色素含量，改善果實營養品質。第一種方式是轉化色素合成途經中的結構基因，例如美國《代謝工程》雜志(Metabolic Engineering.2013,17:59-67)介紹了將番爺中轉入雨生紅球藻β-類胡蘿卜素酮化酶和羥化酶，所獲得的轉基因番茄能夠表達蝦青素。表達外源結構基因來改良植物營養品質是目前植物工程領域應用最多的技術手段。第二種方式是改變光信號途經中某些基因的表達量可以增加果實中色素的含量。例如《美國科學院院刊》(Proc Natl Acad SciU S Α，2004，101 =9897-902)介紹，利用RNA干涉技術(RNAi)技術組成型地干涉番茄光形態建成的正調控基因(LeHY5)的表達，使番茄果實的類胡蘿卜素含量和葉片中的葉綠素的含量下降，而番茄光形態建成的負調控基因(LeCOPlLIKE)的RNAi轉基因番茄，果實中類胡蘿卜素的總含量明顯提高，葉片呈現深綠色。據英國《植物學報》(Plant Journal，2008，55,89-103)介紹，番茄中存在一類單基因的高色素突變體high pigment-1 (hpl)和highpigment-2 (hp2)，這類突變體的成熟果實積累的類胡蘿卜素總量可以達到野生型的三倍，葉片和未成熟的綠果實中葉綠素的含量也比野生型的高。研究發現這類突變體可能影響紅光遠紅光受體(phytochrome)和藍光受體(crytochrome)下游的信號轉導。第三種方式是改變某些與葉綠體發育有關轉錄因子的表達，也能夠顯著的影響果實的品質。如英國《植物學報》(Plant Journal, 2002, 31:713-727)介紹，轉錄因子Golden-like (GLK)在多個物種中調控葉綠體發育，如在擬南芥中AtGLKl或AtGLK2任何一個突變不會影響葉片中葉綠體的發育，但AtGLK2會使種子莢顏色變為淡綠色，AtGLKl和AtGLK2的雙突變，會使得擬南芥葉片中的發育受到影響。GLKs除與葉片中葉綠體發生有關外，GLKs還與果實中葉綠體的發育有關。美國《科學》雜志(Science，2012，336:1711-1715)報道了在番茄中存在兩種與葉綠體發育有關的基因，SlGLKl和S1GLK2，這2個基因在葉片中均表達，但僅S1GLK2在番茄果實中表達。在番茄中分別過表達AtGLKs (AtGLKl或AtGLK2)和S1GLK2均能使番茄色素和糖分含量顯著增加，相反若基因S1GLK2突變會導致著果顏色較淺，成熟后顏色均勻，但糖分，類胡蘿卜素等含量降低。商業培育者利用該基因的突變篩選出顏色均一，賣相好看，但營養品質欠佳的番茄果實。《自然-通訊》(Nat.Commun.2013,4:2640)介紹了本專利技術人課題組前期對紅陽獼猴桃進行全基因組測序，組裝出了全長為616.1Mb，包含39，040個基因的基因組。通過進一步的生物信息學分析，發現了一個與獼猴桃營養品質有關的轉錄調控基因。通過RT-PCR和克隆技術，從獼猴cDNA中獲得了該基因，將該基因克隆至二元表達載體，二元載體轉化農桿菌，轉化的農桿菌侵染番茄愈傷組織，愈傷組織再生獲得的轉基因番茄果實具有較高的色素含量和糖分含量。盡管基因組數據庫(http://bioinf0.bt1.cornel 1.edu/cg1-bin/kiwi/home.cgi)公開了登錄號為Achn385381的獼猴桃EST序列，通過生物信息分析，該EST序列可能與果實營養品質有關，但該序列并不完整，而且還未經過生物學功能驗證。另外，盡管已有許多研究利用外源基因遺傳轉化番茄提高番茄果實品質和色素含量，但之前尚未見到有發現影響獼猴桃營養品質的基因以及該基因在改造果實品質方面的應用。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種能夠提高番茄果實中糖分和色素含量的獼猴桃基因序列，包含該序列的真核重組質粒，以及利用該基因和真核重組質粒提高番茄色素和營養品質以獲得含有高糖分、高類胡蘿卜素含量的番茄品種的方法。本專利技術的能夠提高番茄果實中糖分、色素含量的獼猴桃基因，是根據對獼猴桃全基因組測序結果，利用生物信息學方法進行注釋分析得到一個與果實營養品質有關的EST序列，該序列在獼猴桃數據庫中的登錄號為Achn385381，其特征在于:根據Achn385381序列設計探針并進行同位素標記，同時提取獼猴桃果實RNA，進行反轉錄，構建cDNA文庫，探針與文庫進行雜交，挑取陽性克隆并測序，獲得的如序列表所示的獼猴桃基因序列SEQ IDN0.1。本專利技術的能夠提高番茄果實中糖分、色素含量的重組質粒，其特征在于:根據序列SEQ ID N0.1設計正向引物和反向引物；分別用所述正向引物和反向引物擴增獼猴桃基因序列SEQ ID N0.1，用連接酶連接擴增的PCR產物以及真核表達載體，連接產物轉化大腸桿菌，獲得轉化克隆；所述真核表達載體可選用PBI121、pHB、pM0N1772、pBE12、pBC7或pBA。本專利技術的能夠提高番茄果實中糖分、色素含量的基因和真核重組質粒的應用方法，其特征在于:將含獼猴桃基因序列SEQ ID N0.1的真核表達載體轉化農桿菌，同時將野生型番茄種子進行浸泡溶脹，用次氯酸鈉溶液消毒，然后無菌水清洗，將清洗后的種子放入1/2MS培養基上進行發苗，待子葉發出、真葉長出之前，剪取葉片，置于預培養基上進行培養至產生愈傷，然后將含有獼猴桃基因序列SEQ ID N0.1的真核表達載體轉化的農桿菌侵染預培養番茄葉片，侵染時間5-20分鐘，吸干葉片上的菌液，置于共培養基上培養2-4天，然后將葉片轉移至再生培養基上，每20-30天更換再生培養基一次直至幼苗出現，然后將幼苗轉移至生根培養基上獲得轉基因植株。原公開的獼猴桃EST序列Achn385381僅有420bp，而本專利技術獲得的核酸序列SEQID N0.1長度為1194個核苷酸，經預測本專利技術序列含有完整的閱讀框；由基因SEQ N0.1預測的如后面序列表中所示的氨基酸序列SEQ ID N0.2，氨基酸長度為397個氨基酸殘基。 將本專利技術獲得的上述含獼猴桃基因序列SEQ ID N0.1克隆至真核表達載體，獲得含有獼猴桃基因序列SEQ ID N0.1的質粒，并將該質粒轉化農桿菌，將轉化的農桿菌用于侵染番茄愈傷組織，獲得能夠提高番茄果實中糖分、色素含量的轉基因植株。將采用本專利技術的轉基因番茄果實與野生型番茄果實相比，番茄果實的糖分，番茄紅素，beta-胡蘿卜素，葉綠素的含量能夠獲得明顯提高。結果顯示，本專利技術所述基因和真核重組載體能夠提高果實的營養品質。本專利技術通過基因工程技術克隆獲得的基因，在研究調控果實色素的積累過程和改良果實營養品質方面，具有著重要理論意義和實際應用價值。【附圖說明】圖1為PCR擴增探針雜交陽性克隆所獲得的目的基因片段。圖2為采用本專利技術的植物過表達載本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種能夠提高番茄果實中糖分、色素含量的獼猴桃基因，其特征在于基因序列為SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種能夠提高番茄果實中糖分、色素含量的獼猴桃基因，其特征在于基因序列為SEQID N0.1 所示。2.一種能夠提高番茄果實中糖分、色素含量的重組表達質粒，其特征在于含有權利要求I所述的序列SEQ IDN0.1。3.—種能...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李光偉，牛向麗，周昂，陳丹陽，劉永勝，
申請(專利權)人：合肥工業大學，
類型：發明
國別省市：安徽;34
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