一種雜交鵝掌楸LhPIN3基因及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種雜交鵝掌楸LhPIN3基因及其應用，該雜交鵝掌楸LhPIN3基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發明專利技術在建立成熟的雜交鵝掌楸體胚發生體系的基礎上，克隆生長素運輸蛋白基因LhPIN3，通過表達分析，證明了雜交鵝掌楸的LhPIN3基因在雜交鵝掌楸體胚發生過程中對胚性細胞發育和體胚苗生長有較大的影響，其過表達試驗發現LhPIN3的過表達會影響植株的生長發育，另外LhPIN3的表達還可以部分拯救擬南芥LhPIN3基因功能完全喪失的pin1突變體，使其恢復表型，開花并結出莢果，因此可應用于植物體胚發生、不定根誘導、不定芽的誘導和分化等，具有很好的應用前景。

【技術實現步驟摘要】
—種雜交鵝掌楸A/^/似基因及其應用
本專利技術屬于植物基因工程
，具體涉及一種雜交鵝掌楸基因及其應用。
技術介紹
20世紀生物技術在林木優良材料和新品種的發現與培育中的重要進步是體細胞胚胎發生技術及再生植株培育技術的應用。體胚發生技術由于其兩極性、繁殖速度快、效率高等特點，已經成為優良林木資源快速無性繁殖的重要手段，并且它能和生物反應器結合實現大規模商業化生產。體細胞胚發生的本質是細胞分化的問題，細胞分化使體細胞發育成體細胞胚進而發育成一個完整植株。而細胞分化的分子基礎則是基因差異表達與調控的結果。所以研究這些相關基因可以使我們更好的了解體細胞發生技術的原理。雜交鵝掌楸是我國著名林木遺傳育種家葉培忠教授利用分布在我國的中國鵝掌歌 iLiriodendron chinensis (HemsI.)Sarg.)和分布在北美的北美鶴掌揪(Zirioofeflt/ro/?tulip if era Linn.)通過人工雜交育成的種間雜種。雜交鵝掌楸不僅具有生長快，抗性強，材質好，而且其樹形美觀，花色艷麗，是一種適用于庭院栽培，道路綠化，荒山荒地造林等多種用途的優良樹種。雜交鵝掌楸雖然有許多優越性，但雜交制種受到季節和效率的限制，影響了雜交鵝掌楸的推廣應用，由于植物體細胞胚具有數量多，一旦形成體細胞胚就能夠快速發育成再生植株的特點，以體細胞胚胎發生技術快速繁殖種子來源困難的雜交鵝掌楸，具有重要的理論意義和應用價值。到目前為止，已經成功利用雜交種體細胞建立了雜交鵝掌楸體細胞胚胎發生技術和快速成苗體系，開辟了雜交鵝掌楸產業化開發的新途徑。在雜交鵝掌楸體細胞胚胎發生體系的研究中發現，體細胞胚經過了球形胚、心形胚、魚雷胚與子葉胚全過程，說明其發育過程與合子胚的發育完全相同，而且各個發育時期體細胞胚的形狀與合子胚也非常接近。因此，在研究當中，利用體胚發生系統深入研究體細胞胚發生與發育的機制對于揭示細胞分化、發育、形態發生與胚胎發生發育過程等重大理論問題的機制，以及真核細胞中基因表達和調節控制等具有十分重要的意義。植物生長調節劑的誘導和調節是離體培養條件下體細胞轉化成胚性細胞的重要誘導因子。其中，生長素是誘導體細胞胚發生的關鍵因素。在體細胞胚的發生和發育過程中，生長素的極性運輸和組織中心細胞與干細胞的形成起關鍵作用，它們通過啟動胚性特征基因表達，最終決定體細胞原胚的產生，進而繼續發育形成成熟體細胞胚。造成這種極性運輸的原因是由于在 運輸生長素的細胞中生長素輸出蛋白在質膜上的極性分布所致。很多研究已表明，生長素的運輸蛋白在植物的胚后發育過程及植物的光形態建成和組織分化方面也起著非常重要的作用。生長素在植物組織中的極性分布很大程度上歸功于高度調控、極性定位的輸出載體PINs蛋白。PINs蛋白是生長素的輸出載體，能使生長素從細胞內流出。PINs蛋白家族各成員間存在功能冗余，并受多水平調節。在特異組織細胞中表達的各種PIN蛋白形成一個具有相同生化功能的PIN蛋白系統，此系統組成一個靈活的生長素分布網，對植物體生長發育相關事件作出應答。PIN蛋白是決定生長素流方向的基礎，為植物體的各部分和細胞提供了特異的位置信息和方向信息。所以，PIN蛋白和生長素信號轉導系統共同調節植物體的生長發育。生長素的極性運輸與植物的許多生長發育過程密切相關，但是生長素的調控機制有很多地方認識的都不夠全面。最近幾年，編碼生長素運輸蛋白的基因的克隆使人們對生長素極性運輸的研究取得了很大的進展。截止目前為止，已經從擬南芥中至少克隆出來8個基因，在水稻、玉米等植物中也得到了數個同源基因。根據這些基因在序列上的高度保守性說明在不同植物中也許在其生長發育過程中具有相同的功能。擬南芥中的/ΥΛ7、PIN2、PIN3、PIN4、PIN7已經被證實了在植物早期胚胎發育以及根的向地性、植物的伸長生長以及植物的向性反應中都具有一定的影響。
技術實現思路
專利技術目的:針對現有技術中存在的不足，本專利技術的目的是提供一種雜交鵝掌楸LhPim基因。本專利技術的另一目的是提供雜交鵝掌楸基因在雜種鵝掌楸育種中的應用。 技術方案:為了實現上述專利技術目的，本專利技術采用的技術方案如下: 一種雜交鵝掌楸基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述的雜交鵝掌楸LhPim基因的表達蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的雜交鵝掌楸LhPim基因在雜交鵝掌楸育種中的應用。含有雜交鵝掌楸基因的載體或宿主細胞。PINs蛋白是生長素的輸出載體，能使生長素從細胞內流出。在特異組織細胞中表達的各種PIN蛋白形成一個具有相同生化功能的PIN蛋白系統，此系統組成一個靈活的生長素分布網，對植物體生長發育相關事件作出應答。擬南芥與雜交鵝掌楸的基因的過量表達都導致了植株生長緩慢、發育推遲。生長素對組織中心細胞與干細胞的形成起關鍵作用，通過啟動胚性特征基因表達，最終決定體細胞原胚的產生，進而繼續發育形成成熟體細胞胚。繼而在植物的胚后發育過程及植物的光形態建成和組織分化方面也有重要的影響。有益效果:與現有技術相比，本專利技術在建立成熟的雜交鵝掌楸體胚發生體系的基礎上，克隆了生長素運輸蛋白基因LhPIN’3，通過表達分析，證明了雜交鵝掌楸的LhPIN3基因在雜交鵝掌楸體胚發生過程中對胚性細胞發育和體胚苗生長有較大的影響，其過表達試mhPIN3的過表達會影響植株的生長發育，別\ LhPim的表達還可以拯救擬南芥中功能完全喪失的突變體，使其恢復表型，開花并結出莢果，因此可應用于植物體胚發生、不定根誘導、不定芽的誘導和分化等，具有很好的應用前景?！靖綀D說明】圖1是雜交鵝掌楸總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖2 ILhPim基因全長PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖3是雙酶切反應結果的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖4是表達載體酶切驗證結果的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖5 ILhPim表達載體圖；圖6是不同時期的雜交鵝掌楸材料圖； 圖7是基因在不同時期的實時定量結果圖； 圖8是Tl代種子的篩選結果圖； 圖9是Tl、T2代陽性植株檢測結果圖； 圖10是LhPim過表達轉基因擬南芥表型圖； 圖11良LhPIN3mmjvpinl突變體表型圖； 圖12是轉基因擬南芥葉片組織培養表型圖?！揪唧w實施方式】下面結合具體實施例對本專利技術做進一步的說明。實施例1 以雜交鵝掌楸為材料，提取總RNA，并反轉成cDNA，設計相應引物進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的條帶，與PMD19-T載體連接，轉入大腸桿菌，測序并分析。挑取陽性克隆進行質粒抽提，加入酶切位點后與載體PBI121同時雙酶切，在T4連接酶的作用下連接后，轉入農桿菌GV3101中，待擬南芥適齡后，通過花器官浸泡轉化法進行轉化，觀察Tl，T2代和T3代轉基因純合體再生植株表型。(I)總RNA的提取 以雜交鵝掌楸的側芽為材料，按照NORGEN試劑盒(Norgen Sioid)的操作步驟進行RNA的提取，所使用的試劑和耗材均處理使其無RNA酶。雜交鵝掌楸總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，條帶清晰；測定總RNA的吸光度，OD26tZOD28tl值為1.96，OD260/OD230為2.08，可見RNA質量較好。RNA提取的具體過程為:加入6本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種雜交鵝掌楸LhPIN3基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技術特征摘要】
1.一種雜交鵝掌楸基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.權利要求1所述的雜交鵝掌楸基因的表達蛋白，其氨基酸序列如SEQ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：施季森，袁夢箋，王鵬凱，李霞，陳金慧，李美平，陸葉，
申請(專利權)人：南京林業大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32